1 前言

糖化酶(Glucoamylase, GA)是由微生物分泌产生的，通过催化淀粉从非还原端水解α-1,4糖苷键将β-D-葡萄糖从淀粉及相关底物中释放出来。它们是典型的微生物酶[1]，主要存在于古细菌、细菌和真菌中，已被广泛应用于白酒、酒精、食醋、氨基酸、有机酸等发酵工业[2,3]。黑曲霉糖化酶是具有多个结构域的酶，其淀粉结合结构域(SBD)通过高度糖基化的连接肽与具有(α/α)6-桶构象的催化结构域相连。 论文网

淀粉结合结构域是淀粉降解酶中的一个功能性结构域，主要功能是能促进酶与不溶性淀粉粒结合，从而增加酶在淀粉粒表面的浓度[4]。另一个作用是破坏淀粉粒表面的结构从而提高淀粉分解速率[5]。淀粉结合结构域通常是较小的结构域，其结构在不同的酶之间以及不同的生物之间是非常保守的。在已经发现的69个CBM家族中，具有生淀粉结合能力的家族有11个，即CBM20，CBM21，CBM25，CBM26，CBM34，CBM41，CBM45，CBM48，CBM53 ，CBM58和CBM69，其中CBM69是2014年才确立的家族(资料来自于CAZy数据库，http://www。cazy。org/；更新于2014年3月20日)[6]。到目前为止，CBM20是研究最为透彻的家族。晶体学研究表明，大多数CBM20s具有两个独立的淀粉结合位点，每一个结合位点都具有两个或三个裸露的芳香族氨基酸，这些氨基酸在淀粉结合中起着非常重要的作用[7]。最近的一些研究表明，即使与蛋白的其它结构域分离，淀粉结合结构域仍然具有与不溶性淀粉粒的亲和性。有人将不能与生淀粉粒结合的酶与SBD融合后就具有与生淀粉粒结合的能力[8,9,10]。

本研究从黑曲霉基因组DNA中克隆GASBD基因，用TaqDNA聚合酶对GASBD基因片段进行PCR扩增，将扩增产物与克隆载体pUC-19质粒连接，转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α，通过PCR扩增、双酶切及序列测定，然后用DNAMAN 6。0软件对A。 niger 2316 GASBD的核苷酸和氨基酸序列与已报道的其它曲霉糖化酶SBD进行同源性分析。文献综述

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1 菌株与质粒

黑曲霉2316购于中国工业微生物菌种保藏中心，用于糖化酶淀粉结合结构域基因片段的PCR扩增。克隆载体pUC19质粒，购自于Takara 公司； 

2。1。2  主要试剂

各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自于Fermentas 公司(Vilnius, Lithuania)；TaqDNA聚合酶、DNA marker III购自于南京天为生物公司；；DNA凝胶回收试剂盒购自于南京天为生物公司；PCR产物纯化试剂盒购自上海生工；其它试剂均为分析纯或分子生物学级，购自于上海化学工业集团有限公司。

2。1。3 主要仪器设备

    PCR仪(Eppendorf)、高压灭菌锅(日本)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、超净工作台(苏州净化设备厂)、制冰机和超低温冰箱(SANYO)、培养箱、DYYIII型电泳仪和琼脂糖水平电泳槽(北京六一)。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

2。1。4  培养基

LB(Luria–Bertani)培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7。0。固体培养基含1。5%的琼脂。

2。2 实验方法

2。2。1 黑曲霉基因组DNA的提取

用液氮将1g菌丝体研磨成粉末后，转入离心管中，加10mL缓冲液A (SDS-TE：4﹪SDS，10mM Tris-HCl，0。1mM EDTA，pH 8。0)，混匀后将混合液置65-68℃水浴20min，然后在室温下10000 r/min离心15min。转移8mL上清液到新离心管中，加0。5mL缓冲液B(8M KAc，pH4。2)，混匀后冰浴45min，然后在室温下10000 r/min离心15min。取适量的上清液于另一离心管中并加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min，用玻璃钩将DNA沉淀团缓慢地转移到1。5mL离心管中。DNA沉淀溶于750uL TE(10mM Tris-HCl，0。1mM EDTA，pH 7。5)溶液后，用苯酚-氯仿(1:1)抽提2次，氯仿抽提1次。用等体积异丙醇沉淀后自然凉干，将沉淀溶于500uL TE溶液中，于-20℃保存。