众所周知，线粒体是能量代谢的重要细胞器，对维持细胞功能起了重要作用。心肌是以有氧氧化产生能量为主的组织，富含线粒体。当心肌损伤时，往往会发生线粒体肿胀、线粒体膜流动性下降、线粒体中ATP生成减少、氧自由基增多、丙二醛升高等一系列变化[49]。而线粒体受损造成细胞能量代谢紊乱，损伤积累到一定程度后便可使细胞进入不可逆的坏死过程。因此，我们推测纳米TiO2暴露引起心血管毒性及心肌功能的破坏可能与心肌细胞线粒体结构和功能的破坏有关，这方面值得研究。

鉴于此，本论文用不同剂量（0、1。25、 2。5和 5 mg/kg BW)连续滴鼻处理小鼠9个月，通过电镜观察心肌细胞的超微结构变化；通过荧光共聚焦显微镜观察线粒体膜电势变化；通过分析心肌细胞的氧化应激水平、抗氧化能力和线粒体功能相关生化指标及其线粒体介导的细胞凋亡相关因子蛋白表达变化，以证实纳米TiO2长期暴露是否引起线粒体结构和功能损伤并探讨其分子作用机制。

2 材料与方法文献综述

2。1 化学物制备和表征

本实验所用纳米TiO2由苏州大学杨平教授合成并赠送(锐钛型，粒径 约5 nm，纯度大于99。5%)。经实验室表征粒径大小应为5-6 nm；悬浮液聚集颗粒直径范围为208-330 nm，均值为294 nm；比表面积为174。8 m2/g；zeta电势为9。28 mV[50,51]。

2。2 实验动物和处理

从苏州大学动物中心购买实验用的80只CD- 1（ICR）雌性小鼠（SPF级，20±2 g）。所有小鼠均饲养于通风的不锈钢笼子中，室温保持在24±2°C，相对湿度为60±10％和12小时的光/暗周期。小鼠可自由取食蒸馏水和灭菌食物。在处理前要对它们驯化5天，以使其适应环境。实验用的纳米TiO2悬浮于羧甲基纤维素(HPMC，颗粒分散剂，0。5% W/V)溶液中，然后超声波振荡处理30 分钟、机械振荡5分钟，以确保其充分分散。实验动物随机分为4组（N=20）：对照组和3个实验处理组。实验组分别用1。25、2。5和5 mg/kg BW的纳米TiO2对小鼠持续滴鼻给药9个月，剂量选择参考有关文献[52]，对照组处以0。5% w/v HPMC。在纳米TiO2暴露期间，每天观察并记录小鼠的症状和有无死亡情况。

2。3 心肌细胞分离

饲养9个月后，小鼠麻醉后快速取出心脏，采用Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注，无钙Krebs-Henseleit缓冲液(KH液)非循环灌流4 min，0。6 g/L Worthington 2型胶原酶联合0。03 g/L蛋白酶消化约15 min，剪下心室组织于消化液和10 g/L牛血清白蛋白的混合液中，剪碎后于37 ℃振摇孵育10 min，200 m尼龙网过滤，500 g离心1 min，梯度复钙，自然沉降。

2。4形态学观察 

分离即刻的心肌细胞，倒置显微镜下观察可见大部分细胞呈长杆状，为存活细胞。少数细胞皱缩成圆形或椭圆形，为死细胞。复钙后，约3/4的心肌细胞维持杆状形态，胞膜完整，纹理清晰。

2。5电镜观察

分离的心肌细胞用含2。5%戊二醛的0。1M磷酸酸盐缓冲液固定2 h，用0。1M磷酸酸盐缓冲液（pH 7。2-7。4）清洗三次，用1%锇酸固定1 h。标本用一系列丙酮浓度（30%、50%、70%、80%、90% 、100%）逐级脱水，最后用Epon812环氧树脂包埋。做好的超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，于H-600 TEM型透射电子显微镜（HITACHI Co。, Japan）下进行超微结构观察。

2。6心肌细胞线粒体膜电位（MMP）的测定来-自~优+尔=论.文,网www.youerw.com +QQ752018766-

分离的心肌细胞MMP用MMP试剂盒JC-1荧光探针标记，用莱卡SP8激光扫描共焦显微镜（LSCM）观察拍照。JC-1是一种广泛用于检测MMP的理想荧光探针[23]。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；损伤的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。心肌细胞线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量