六六六是一种具有高毒性和长残留性的环境污染物。六六六又名六氯环己烷(Hexachlorocyclohexane, HCH)，是一种有机氯杀虫剂，在20 世纪70 年代前曾在世界范围内被广泛使用[1]。六六六在环境中的自然降解缓慢，半衰期长达几十年，甚至上百年，在2010 年被联合国环境规划署(United nations environment programme, UNEP)列入持久性有机污染物(Persistent organic pollutants, POPs)名单[2]。六六六因其广谱毒性和长期残留性而引起世界范围内广泛关注。Weber 等科学家在2008 年估计，全世界共合成了(4−6)×106 吨六六六并释放到环境中，在规模上相当于其它所有持续性有机污染物(POPs)释放数量的总和。六六六的残留在世界许多国家的空气、水、土壤、食物、牛奶、鱼类和哺乳动物中均被检出，甚至人的血液和脂肪组织中也有六六六残留，即使一些远离六六六生产和使用的地区，甚至从来没有生产和使用过六六六的地方，诸如北极、南极和太平洋中也被检测出有六六六的残留[3]。虽然六六六在发达国家被限制或禁止使用，但是在印度和一些热带国家与地区，六六六仍然在生产和使用[4]，所以它在全世界的残留污染问题依然存在。

目前已经报道了一些能够降解六六六的微生物，其中最具代表性且研究比较详细的菌株包括从日本分离到的Sphingobium japonicum UT26、从法国分离到的Sphingobium francense Sp+ 和从印度分离到的Sphingobium indicum B90A。国内报道的六六六降解菌株主要有BI 菌株[5]和BHC-A 菌株。此外，国内外研究者还分别从降解途径、基因等水平上阐明了六六六微生物降解的机理，其中菌株UT26 的全基因组序列已于2010年经完成[6]。

UT26降解六六六的代谢途径

而降解菌株在六六六污染场地中的存活和定殖、降解基因的表达情况，以及菌株与土著微生物之间的相互竞争和影响等一系列生物学行为与最终能否取得理想的修复效果之间有着极其重要的相关性。但目前，这方面的研究还比较缺乏，因此深入研究降解菌在六六六污染场地修复过程中的生物学行为，并将其与最终的修复效果相偶联，阐明六六六污染场地微生物修复效果背后的微生物学和分子生物学原理，能够为该菌株在六六六污染场地微生物修复中的应用提供理论参考，具有较好的科学价值和应用价值。

LinED是菌株UT26中降解六六六的关键基因之一， LinD在菌株降解六六六的代谢途径中负责催化使苯环上的氯除去，LinE在菌株降解六六六的代谢途径中负责催化使苯环打开。本文拟构建该基因的启动子与报告基因的融合表达载体，用以研究菌株在修复六六六污染土壤过程中该基因的表达情况。

2  材料与方法

2。1  供试菌株和质粒

   大肠杆菌DH5α菌株，用于制备感受态细胞；

pMD18-T：购自TaKaRa公司，氨苄（AMP）抗性；

pUBC19-gfp：本实验室保存，含有报告基因gfp，氨苄（AMP）抗性；

pT-PLinED-gfp：本文构建，氨苄（AMP）抗性；

pBBR1MCS5：广宿主表达载体，可通过三亲结合方法转移至目标菌株中进行外源基因表达，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，庆大霉素（GM）抗性；

p5- PLinED-gfp：LinED基因启动子区与报告基因gfp融合片段构建与广宿主表达载体pBBR1MCS5上，保存于大肠杆菌DH5a菌株中，庆大霉素（GM）抗性。

2。2  试剂和溶液

本文实验过程中所用的酵母粉蛋白胨和PEG3350为进口试剂，分别购自Oxide（英国）和Sigma（美国），各种抗生素购自生工生物工程有限公司（中国上海），其他普通试剂均为国产分析纯试剂。