1.1.4主要仪器
电磁炉,锅,容量瓶,烧杯,锥形瓶,纱布,电子天平,分光光度计,pH计,试管,培养皿,酒精灯,玻璃棒,滴定管,移液管,移液枪,接种环,接种针,离心机,恒温箱,恒温震荡培养箱,超声波破碎仪,灭菌锅,超净工作台,电泳仪等。
1.2 试验方法
1.2.1 酵母活化
(1) 取10支试管分别装入9 mL蒸馏水,加棉塞用报纸包好,放入灭菌锅中随培养基和培养皿灭菌,条件0.105 MPa,121 ℃,20 min。然后放入超净工作台中自然冷却至50~60 ℃。
(2) 称取1 g安琪甜酒曲放入1号试管,震荡,用移液枪吸取1 mL加入2号试管中,依次到10号试管。将冷却好的YPD培养基均匀倒入10个培养皿中,编号1~10,直至冷却凝固。用移液枪吸取试管中的液体10 μL于相对应的培养皿中涂布均匀,放入恒温培养箱中,30 ℃下培养24 h[10]。
1.2.2 酵母菌的初筛
(1) 利用YPD液体培养基进行梯度稀释初选:取10支试管加入9 mL蒸馏水,加棉塞,报纸包装随培养皿和装有YPD培养基的锥形瓶一起灭菌,条件为0.105 MPa,121 ℃,20 min。将灭菌好的材料,仪器拿到超净工作台中操作。
(2) 取长势较好的菌落,用接种环接取一环放入1号试管,震荡,然后用移液枪吸取1 mL放入2号试管,依此到10号试管。再用移液枪吸10 μL于对应的培养皿中,涂布均匀,放入恒温培养箱中,30 ℃培养24 h。
1.2.3 酵母菌的复筛
(1) 培养皿5个一组用报纸包好和装有YPD固体培养基的锥形瓶一块放入灭菌锅中进行灭菌,条件0.105 MPa,121 ℃,20 min。将灭菌好的器材放入超净工作台中。
(2) 待培养基冷却至50~60 ℃时倒平板,直至培养基完全凝固。点燃酒精灯,用接种针挑取长势最好的进行划线,将划线过的培养皿放入恒温培养箱中培养,条件为30 ℃培养24 h。
1.2.4 酵母菌的鉴定
(1) 24 h过后观察划线的酵母,划线培养后酵母能够形成单一菌落,但都成圆状,乳白色,表面光滑湿润不干燥,中央有白色凸起。
(2) 取一载玻片滴入一滴美蓝溶液,再用接种针在菌落最小处挑取少许,放入滴在载玻片的美蓝中,用接种针搅拌均匀,盖上盖玻片,在显微镜下进行观察。
1.2.5酵母菌的扩大培养
(1) 配制500 ml YPD液体培养基,分装到5个100 mL锥形瓶中。
(2) 挑取镜检下菌落接种到锥形瓶中,放入摇床中进行扩大培养,条件为150 r/min,30℃,26 h。
(3) 分别在600 nm下测定培养15 h,17 h,18 h,19 h,24 h,25 h,26 h的酵母菌液的OD值
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