1 材料与方法

1。1 供试昆虫

试验所用的杂拟谷盗为实验室种群，置于29 ℃、相对湿度70% 的恒温恒湿培养箱中，在小麦全麦面粉中进行繁殖扩群。根据杂拟谷盗的繁殖和生长发育时间，定期筛选并收集成虫。所用的成虫阶段的试虫在蛹期鉴别雌雄并分开饲养，收集羽化后的杂拟谷盗成虫。将所有试虫的头部在体视显微镜下摘取，材料收集后分装在细胞冻存管中放入液氮保存备用。

1。2 杂拟谷盗头部总RNA的提取

(1) 取50-100mg杂拟谷盗头部组织直接放入液氮预冷的研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末状，转入加有1ml细胞裂解缓冲液（1% SDS，50 mmol/L Tris-HCl， 25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA）的离心管中；

(2) 在EP管中加入0。2ml的氯仿，上下震荡混匀，室温下静置5min ；

(3) 将EP管放入高速冷冻离心机中，4 ℃，12000rmp离心15min，取上清液；

(4) 将约500ul的上清液转移到离心柱中，加入250ul的无水乙醇，充分混匀，4 ℃ 12000rmp离心1min，弃掉收集管中的废液；

(5) 加入500ul RNA漂洗液，静止1min，12000rmp离心1min ，弃掉收集管中的废液；

(6) 将离心柱转移到无RNAse离心管中，加入30-50ul DEPC处理的水12000rmp离心1min；

(7) 收集提取的RNA放入-20 ℃的冰箱中备用。

1。3 cDNA第一条链的合成

(1) 在灭菌的DEPC水处理后的EP管中分别加入1ul的3-RACEP1 (0。5ug/ul)和2ul的RNA模板，用水补充至体积为13ul；

(2) 将步骤1中的加完样的EP管放入70 ℃的水浴中5min，取出放入冰浴中冷却5min；

(3) 在上面的EP管中根据下表依次分别加入下表这些试剂：文献综述

成分 体积(μL)

5×第一链缓冲液 4

dNTP 2

核酶抑制剂 0。5

           MMLV 0。5

加水至 20

(4) 混匀EP管中的样品，离心后，放置于42 ℃ 水浴锅中60min；

(5) 将EP管于95 ℃下加热5min，灭活反转录酶；

(6) -20 ℃保存cDNA，备用。

1。4 TDT加尾反应

在微量离心管中配制下列反应液，全量为50ul，37 ℃下反应30min。

成分 体积(μL)

5X TDT buffer 10

0。1% BSA 5

10mM DGTP 2。5

TDT 15

第一链合成产物 20

双蒸水 up to 50 

1。5 LW视蛋白基因的克隆

1。5。1 引物设计

根据NCBI上GenBank中公布的序列，用软件Primer premier 5。0自行设计两对引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。通过特异性引物进行巢式PCR，引物见下表1-1和表1-2。

表1-1 LW巢式5’ RACE PCR引物

Table 1-1 LW 5’ RACE Nested PCR primers

接头引物

5RACEP1 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACCCCCCCCCCCCCCCCC-3’

5RACEP2 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

特异引物

lv51 5’-GAGTATCCTCAACATAGCCCCTTTTTTCG-3’

lv52 5’-CATTGTACCTATCCAAAGCGAT来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-GAC-3’

表1-2 LW巢式3’ RACE PCR引物