10× TE Buffer: 称取12。114 g 0。1M Tris-HCl，2。92 g 0。01M EDTA，用灭菌水定容至1 L，121 oC，灭菌15 min，保存于4 oC冰箱。

10× LiOAc: 称取65。99 g 1M LiOAc，用灭菌水定容至1 L，121 oC，灭菌15 min，保存于4 oC冰箱。

PEG-LiOAc: 10 μl体系：8 μl 50%PEG, 1 μl 10× TE Buffer, 1 μl 10× LiOAc。

1。1× TE-LiOAc: 10 ml体系：1。1 ml 10× TE Buffer, 1。1 ml 10× LiOAc, 7。8 ml去离子水。

1。2实验方法

1。2。1引物设计

从拟南芥数据库TAIR (http://www。arabidopsis。org)分别下载PLANTKAP (AT3G17340)、IMPα-3 (AT4G02150)和NPR1 (AT1G64280)的基因序列，利用Primer Premier软件设计引物，然后进行BLAST比对。在PLANTKAP和NPR1的上游引物和下游引物中分别从5’端引入EcoR Ⅰ和BamH I的酶切位点。在IMPα-3的上下游引物中分别Nde I和EcoR Ⅰ的酶切位点。具体引物序列见表1。

表 1 PCR引物序列

引物名称 引物序列（5'→3')

NPR1上 GCGAATTCATGGACACCACCATTG

NPR1下 TTGGATCCTCACCGACGACGATGA

PLANTKAP上 GAATTCATGTTCGTCGGCGACGAC

PLANTKAP下 GGATCCTTAGAGGCACTTAGAGAA

IMPα-3上 ATGCCATATGATGTCTCTCAGACCTAGCGC

IMPα-3下 GCCGGAATTCTCAAATAAAGTTGAATTGAC

注：划线部分为酶切位点

1。2。2拟南芥总RNA的提取

将经低温冻结的拟南芥幼苗整株置于用液氮预冷的研钵中，研碎，研钵提前经过高温高压消毒。在1。5 ml EP管中加1 ml的Trizol试剂及0。1 g上述研磨材料，充分混匀，冰孵5 min，4 oC，12000 g离心10 min。取上清，加入200 μl预冷的氯仿，剧烈振荡混匀，冰上静置2-3 min后，4 oC，12000 g离心15 min。再取上清，加入500 μl预冷的异丙醇，冰孵10 min，4 oC，12000 g离心10 min。弃上清，用1 ml预冷的75%的乙醇洗涤沉淀，混匀，4 oC，7500 g离心5 min。弃上清，沉淀干燥5-10 min，加入40 μl DEPC水溶解，而后取微量样品进行电泳检测，剩余样品保存于-80 oC冰箱中。

1。2。3 RT-PCR获得目的基因

以拟南芥中提取的总RNA为模板，采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Code No。6110A)试剂盒进行cDNA第一链的合成，具体操作可参照其说明书。而后以单链cDNA为模板，采用基因特异性引物，进行常规PCR扩增，获得PLANTKAP、NPR1、IMPα-3基因。第一链cDNA合成反应液的添加量一般不超过PCR反应体系的1/10。扩增PCR反应体系（50 μl）：1st Strand cDNA 2 μl，上下游引物混合物4 μl，Kodage 2× PCR Master Mix/with dye 25 μl，Nuclease-free H2O 19 μl。变性温度为94 oC，时间为30 s（初始变性时间设置为3 min），复性温度为55 oC，时间为30 s，延伸温度为72 oC，时间按1 min/1 kb换算（最终延伸时间为5 min），共进行34轮循环。

通过查询拟南芥数据库TAIR (http://www。arabidopsis。org)可知，PLANTKAP的CDS全长为3282 bp、IMPα-3的CDS全长为1596 bp和NPR1的CDS全长为1782 bp。扩增完成后，取少量样品，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的基因条带正确，即可进行胶回收。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

1。2。4回收PCR扩增产物

将目的基因PLANTKAP、NPR1、IMPα-3的特异性扩增条带从胶上切下后，用翼飞雪生物科技公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收。在已称重的1。5 ml EP管中，加入带有目的基因条带的凝胶块，再次称量，得出凝胶块重量，然后按1：3的体积比加入的Buffer KG（0。1 g算作100 μl），50-65 oC水浴5-10 min。将完全溶解的溶胶液转移至吸附柱内，室温，12000 g，离心1 min。重复1次后，加入700 μl的Buffer KW，室温，12000 g，离心1 min。弃滤液，12000 g离心2 min。取出吸附柱放入干净的1。5 ml EP管中，加30-40 μl超纯水于吸附膜中央，室温，12000 g，离心1 min。测OD值，检验回收纯度，剩余样品可冻存于-20 oC。