提取DNA的具体方法是：

（1）首先分别在1。5 mL离心管中加入30μL的Buffer ATL，接着用毛笔尖挑取一只雌性成螨置于离心管的Buffer ATL溶液中，每管保证只有一头雌螨。用一次性研磨棒进行充分研磨，再向其中加入150μL Buffer ATL，加入时同时注意冲洗研磨棒；

（2）随后向每管中分别加入20μL的蛋白酶K，并且充分震荡离心，于56℃水浴中孵育3小时，直到叶螨的可见组织完全被消解。

（3）首先涡旋混匀15s，再向其中分别加入200μL的Buffer AL后，再次涡旋充分混匀离心。值得注意的事，如果在此过程中看到沉淀，则需要放入56℃水浴中进行加热，大约在10分钟左右沉淀即能消失。随后加入200μL的100%无水乙醇后，再次充分涡旋离心。

（4）将所得的混合液全部转移至装有Dneasy过滤柱的洁净的2mL收集管中，在离心机中以13000g转速离心1min，离心完毕后弃滤液以及收集管。

（5）将过滤柱放入新的收集管中，随后向柱中加入Buffer AW1 500μL, 在离心机中离心1min以13000g的转速，随后弃滤液和收集管。

（6）将过滤柱继续放入新的收集管中，往柱中加入Buffer AW2 500μL, 在离心机中离心3min以20000g转速，随后弃滤液和收集管。

（7）最后，把过滤柱置入新的1。5mL离心管中，分别加入去离子水各100μL，室温等待2~3分钟后在离心机中离心1min，以13000g的转速，过滤后即为所需要的叶螨DNA，于-20℃下保存备用或者直接进行PCR。

1。4 mtDNA-cytb与wsp基因的扩增及测序

通过Wolbachia上的wsp基因扩增来对样本中的Wolbachia进行检测。

上游引物：TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC

下游引物：来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-ATTAAACGCTTACTCCA

扩增反应体系：20μL

表1 wsp基因扩增体系成分表

组分 体积（μL）

ddH2O 7。9

Mix 10

上游引物（25μmol/L） 0。3

下游引物（25μmol/L）

DNA模板 0。3

1。5

扩增条件为：

95℃ 2min 

95℃ 30s 

54℃ 30s 

72℃ 45s 

72℃ 10min

12℃ ∞  （阳性对照为Wolbachia溶液，阴性对照为水。）

设计引物对mtDNA-cytb进行扩增及测序

上游引物：ATAACTATAACATCAGCTTTTATAGG

下游引物：TAAAGTTATAACT来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-TTATAATTAATCC

扩增反应体系：25μL

表2 mtDNA-cytb扩增体系成分表

组分 体积（μL）

ddH2O 10。5

10×buffer 12。5

E（5U/μL） 0。5

上游引物（25μmol/L） 0。25

上游引物（25μmol/L） 0。25

DNA模板 1

扩增条件为：

94℃ 1min

98℃ 10s 

55℃ 15s 

68℃ 1min

68℃ 10min

12℃ ∞

在得到扩增产物之后，通过琼脂糖凝胶电泳对其进行质量检测，步骤是：

取出之前得到的PCR扩增产物5μL，在2。0%（g/ml）的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。电泳检测使用的缓冲液是1×TAE，整个电泳过程中，电压为130V，在电泳20分钟后通过Bio-Rad Gel Doc EQ的凝胶成像系统对电泳结果进行观察并拍照记录。