怀菊花活性成分及抑菌作用研究(2)
主要仪器：AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、格兰仕WD800型微波炉（顺德市格兰仕微波炉电器有限公司）、HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、SHB-III循环水式真空泵（郑州欧卡仪器设备有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、HC-3018高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、LRHS-150B恒温恒湿培养箱（常州诺基仪器有限公司）、UV-5100型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。
1.2怀菊花多糖的提取和含量测定
采用苯酚--硫酸法[5]测定多糖的含量。原理：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定多糖含量。
1.2.1多糖标准曲线的绘制
分别准确移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL浓度为100 μg/mL的葡萄糖标准溶液，分别置于1 mL试管中，各加蒸馏水补足至刻度，再各加入6%的苯酚溶液1 mL，摇匀，依次加入5 mL 98%的浓硫酸，摇匀，静止15 min后，置于40 ℃的条件下30 min，冷却，于波长490 nm处测定吸光度D490 nm，结果如图1。将待测管中葡萄糖浓度（x）与吸光度（y）作回归处理，得回归方程y=0.0073x-0.0188。
表1 葡萄糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖浓度
C（μg/mL） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
吸光度A 0 0.036 0.147 0.165 0.286 0.341 0.404 0.491 0.566 0.641
图1 葡萄糖标准曲线
1.2.2怀菊花多糖的提取工艺流程[6-8]
微波辅助提取技术，利用微波有效破坏细胞壁而加快活性物质的溶出，而且可使难溶物质在微波的作用下很好的溶解，从而提升了提取的效度和提取率。
微波辅助提取法：干燥的怀菊花→剪碎称取20 g→加入500 mL蒸馏水→在70 ℃温度下水浴浸泡2 h→微波提取一次→抽滤→微波提取一次→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1）后充分摇匀（目的除去蛋白质）→离心（3000 r/min，10 min），取上清→烘箱内低温浓缩→浓缩液与乙醇比为1:3加入无水乙醇，使多糖沉淀→静置过夜→（3000 r/min，15 min）离心，取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶→提取率测定。
热水浸取法：干燥的怀菊花→剪碎称取20 g→加入500 mL蒸馏水→在70 ℃温度下水浴浸泡24 h→抽滤→再次在70 ℃温度下水浴浸泡24 h→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液（氯仿:正丁醇=5:1）后充分摇匀（目的除去蛋白质）→离心（3000 r/min，10 min），取上清→烘箱内低温浓缩→浓缩液与乙醇比为1:3加入无水乙醇，使多糖沉淀→静置过夜→（3000 r/min，15 min）离心，取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶→提取率测定。
1.2.3怀菊花多糖提取率的测定
从粗提取液中各取出1 mL，置于10 mL试管中，各加入1 mL 6%的苯酚溶液，摇匀，依次加入5 mL的98%浓硫酸，摇匀，静止15 min后，置于40 ℃的条件下30 min，冷却，于波长490 nm处测定光度。根据回归方程算出测量多糖的C0（μg/mL），按照以下公式计算提取物多糖的提取率（mg/g）。
上一篇：几株乳酸菌产酸性能的差异比较