1。3。3  细胞灭活苗 11

1。3。4  细胞弱毒苗 11

1。3。5  转基因植物疫苗 12

1。3。6  联苗 12

1。4  猪流行性腹泻病毒发病机理 13

1。5 本课题研究的目的和意义 13

1。5。1  研究目的 13

1。5。2  研究意义 14

1。6 实验内容与研究路线 15

1。6。1  本实验研究内容 15

1。6。2  本实验研究路线 16

第二章 实验材料及方法 17

3。1 实验所用试剂 17

3。1。1 实验中所使用的培养基 17

3。1。2 实验中的所使用的主要试剂盒成分 17

3。1。3 琼脂糖凝胶电泳试剂 17

3。1。4  酶 18

3。1。5 常用溶液的配制 18

3。2  主要实验仪器 19

3。3  实验方法 20

3。3。1  培养基 20

3。3。2  引物设计 20

3。3。3 PCR 扩增 21

3。3。4 SDS-碱裂解法小量抽提 pET28a(+)质粒 22

3。3。5 PEDV coe 基因与 pET28a(+)载体同源重组连接 23

3。3。6 pET28a(+)-coe 重组质粒单酶切 24

3。3。7 TOP10 和 DE3 感受态细胞的制备 24

3。3。8 pET28a(+)-coe 重组质粒转化 TOP10 感受态细胞 25

3。3。9  阳性克隆的筛选 25

3。3。10 pET28a(+)-PEDV coe 菌液 PCR 初步鉴定 25

3。3。11 pET28a(+)-PEDV coe 测序 26

3。3。12 coe 基因表达载体的构建 26

3。3。13 IPTG 诱导表达 27

3。3。14 PBS 处理蛋白 28

3。3。15 SDS－PAGE 蛋白电泳 28

第三章 结果与讨论 29

4。1 PEDV 的基因结构及 S 基因和 coe 基因进化分析 29

4。2 PCR 扩增 coe 基因结果 31

4。3 pET28a(+)-PEDV coe 重组质粒单酶切鉴定结果 32

4。4  重组子转化 Top10 结果 32

4。5 pET28a(+)-PEDV coe 菌液 PCR 鉴定 33

4。6  重组 pET28a(+)-PEDV coe 载体的测序结果 33

4。7  鉴定正确的重组 pET28a(+)-PEDV coe 载体转化 BL21 表达菌 34

4。8 PEDV coe 基因的表达 34

结