本研究采用高通量测序和生物信息学分析技术系统地分析了16S rRNA基因，通过一系列的多样性指数分析和分类学分析，快速精确地确定整个肠道的细菌群落组成，为进一步研究细菌物种与奶牛身体状况之间的相互关系及在整个肠道中的作用机理提供了理论基础。

2 材料与方法

2。1材料

2。1。1供试奶牛

   供试奶牛为徐州绿润养殖合作社的中国荷斯坦奶，奶牛编号分别为A1、1、12、106、110、130，其体重、体长、年龄、胎次、日均产奶量等基本情况见表2-1。待实验6头中国荷斯坦奶牛，每头每天喂食羊草（1kg），进口苜蓿草(3。5kg)，豆粕(0。75kg)，青贮饲料(22kg)，棉籽(2kg),自由饮水，自由运动。

表2-1 6头中国荷斯坦奶牛体况表

编号 A1 1 12 106 110 130

体重/kg 650 600 609 580 550 580

体长/m 1。73 1。70 1。72 1。68 1。73 1。70

年龄/岁 6 5 5。6 5。2 5。5 4。8

胎次 4 2 2 1 2 3

日产奶量/kg 42 10 30 12 30 20

2。1。2试剂盒

 Stool DNA kit粪便基因组DNA快速提取试剂盒购自上海士峰生物科技有限公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工有限公司。

2。1。3仪器设备

三角烧瓶、试管、量筒、离心管、移液枪、微量移液器、冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡器、水浴锅、电泳仪、荧光透射仪、酒精灯、高速冷冻离心机、PCR扩增仪、凝胶成像分析系统、落地冷冻摇床。文献综述

2。2实验操作

2。2。1采集样品

从徐州绿润养殖合作社的中国荷斯坦奶牛后肠道中取样，样品放入无菌试管置于4℃冰箱保存。

取10g粪便样品于试管中，加入15ml无菌水，置恒温振荡器中，160rpm震荡12h，取上清液。

2。2。2粪便微生物宏基因组的提取

参照Stool DNA kit粪便基因组DNA快速提取试剂盒的使用说明，按照步骤进行操作，最终产物为粪便中的所有细菌DNA。

2。2。3 16SrRNA的扩增

采用聚合酶链式反应扩增，得到16s rRNA的基因，PCR扩增体系中以DNA为模版，正向引物和反向引物分别为F338（5’—ACTCCTACGGGAGGCAGCAG—3’）[15]和R806（5’—GGACTACVSGGGTATCTAAT—3’）[16]。采用1%琼脂糖凝胶对扩增后的全部产物进行电泳检测。

2。2。4 PCR 扩增产物胶回收

将上一操作得到的含PCR产物的凝胶在荧光透射仪上，用刀片切下发出荧光的一小块凝胶放入离心管中，称重后，按照一定比例加入溶胶液（每100mg胶加入400μl溶胶液）,55℃水浴至胶体完全溶解。参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明完成回收胶体中的扩增产物。