图1。 Hg2+荧光法检测示意图

Figure 1。 Scheme of fluorescent Hg2+ detection

1实验部分

1。1 实验仪器

RF-5301PC 荧光分光光度计（Shimadzu, 日本），pHS-3E pH 计（上海雷磁仪器厂）； GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

寡聚脱氧核糖核苷酸序列(上海生物工程技术有限公司)，HgCl 2，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠（阿拉丁试剂有限公司，分析纯），实验所用缓冲溶液是10 mmol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7。0）核酸外切酶从大连宝生物购买。其他试剂都是分析纯级别。实验中所有的溶液配制都使用超纯水。文献综述

1。2 实验方法

1。2 寡聚脱氧核糖核苷酸序列的设计

如表1所示，本实验设计寡聚脱氧核糖核苷酸序列Oligo 1 作为发卡探针, 序列Oligo 2作为检测探针。

表 1 DNA序列的设计

Table 1 Design of DNA sequences。

Oligo 1: 5'-6-FAM-GTGGAGTTCTGTCCTATCGCTCCTCTCCAC-BHQ-1-3'

Oligo 2: 5'-TGGTGCGTTTGGTCTGTA-3'

1。3 荧光光谱法实验

本实验使用的荧光光谱仪在室温下测定了样品的发光光谱。实验使用 450 nm 为激发波长，扫描 505-600 nm 范围内的荧光光谱，激发和发射狭缝宽度都是10 nm。定量分析中，测定最大发生波长 520 nm 处的荧光强度值，通过荧光强度值对被测物浓度的线性关系实现被测物的定量检测。

2 结果分析

2。1 Hg2+的荧光法检测

为了考察该论文设计方法检测Hg2+的可能性，我们检测了分子发卡探针在不同条件下的荧光信号。如图2所示，单独的发卡探针有非常弱的荧光信号（曲线a），当一定量的检测探针加入之后，荧光信号没有明显改变（曲线b）。然而，当加入50 pmol/L的Hg2+之后，荧光信号有明显的增加（曲线c）。并且，本论文结合酶切割循环放大技术之后，其荧光信号呈现很大程度的增强（曲线d）。

图2。Hg2+的荧光法检测

a) 发卡探针

b) 发卡探针和检测探针

c) 发卡探针和、检测探针和50 pmol/L的Hg2+

d) c)经过酶切割循环放大信号之后

Figure 2。 Fluorescent detection of Hg2+ 

a) Hairpin probe

b) The mixture of hairpin probe and detection probe

c) The mixture of hairpin probe and detection probe in the presence 

of 50 pmol/L Hg2+

d) c)after the cleavage with cleavage enzym

2。2 实验条件优化来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

    荧光团标记的发卡探针荧光信号的恢复主要是基于检测探针在Hg2+存在下T-Hg2+-T化学键的形成，使得发卡探针的发卡结构得以打开。因此，发卡探针和检测探针的杂交时间将直接影响该传感器的检测信号。如图3A所示，传感器的荧光强度随着发卡探针和检测探针杂交时间从5分钟到40分钟的增加而增加，随后达到一个平台。因此，我们选择40分钟最为发卡探针和检测探针杂交的最佳时间。

 实验主要是通过切割酶实现信号的循环放大。因此，切割酶的浓度直接决定传感器的性能。这里我们优化了切割酶的浓度。如图3B所示，当切割酶的浓度达到40 U时，荧光强度与发卡探针没有打开时的最初荧光信号对比增加最多。因此，本实验选择30 U的切割酶作为实现信号循环放大的最佳浓度。

 实现荧光信号循环放大另一个因素是切割酶对双螺旋DNA的切割。因此，切割时间直接决定荧光团和检测探针释放的数量。如图3C所示，荧光强度与发卡探针没有打开时的最初荧光信号对比，随着切割时间从5分钟到60分钟的增加而增加，随后达到一个平台。因此，我们选择60分钟作为最佳切割时间。