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之后的十六世纪，也是文艺复兴的鼎盛时期，文艺复兴三杰将人文主义发挥到极点，用世俗化的手法来表现宗教传统故事。再加上当时女性肖像画的兴起，莎乐美在这个时期发生重大转变的文化背景就基本确定了。十六世纪的莎乐美逐渐脱离《圣经》里的故事背景，出现在观众面前的莎乐美旁边的人物越来越模糊，莎乐美的独立化和中心化越来越突出，女性特点也表现的更加明显。此时有关莎乐美的肖像中，莎乐美都表现的眼神忧郁，面带愧疚，不忍心直视约翰首级。意大利“油画之父”提香的《莎乐美与约翰首级盘》是十六世纪表现莎乐美主题的代表作。画中的莎乐美目光柔和，神态安静，以怜悯的表情侧视先知约翰的首级，让人好像能直视她的内心，这样的莎乐美更接近于尘世，也进一步蜕变成为文学艺术家热衷塑造的美丽女主角。