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摘要本研究用短尾蝮（Gloydius brevicaudus）、乌苏里蝮（Gloydius ussuriensis）、岩栖蝮（Gloydius saxatilis）、原矛头蝮（Protobothrops mucrosquamatus）和菜花原矛头蝮（Protobothrops jerdonii）五种蛇毒的混合物通过加热减毒制备类毒素，免疫20-22周龄莱航母鸡并收集鸡卵，用冻融法、水稀释法和PEG法提取卵黄多价抗蝮蛇毒IgY，并用酶联免疫法（ELISA）和蛋白印迹法（western blot）对所得IgY效价进行检测。结果表明，母鸡在免疫期间产下的鸡卵中，均存在可有效中和上述五种蛇毒的卵黄抗体IgY，且诱导量随免疫强度的提高而增加。不同方法所得有效抗体的含量存在一定差异，且同一提取法所得抗体对不同蛇毒的交叉中和能力也不同，这可能是动物对五种蛇毒的免疫应答存在差异。本研究为高效卵源性多价抗蝮蛇毒IgY的制备与应用奠定了基础，有望为蛇伤患者提供新的治疗药物。43893
Abstract We used toxoid prepared from complexity of snake venoms from Gloydius brevicaudus, Gloydius ussuriensis, Gloydius saxatilis, Protobothrops mucrosquamatus and Protobothrops jerdonii to immunize the 20-22 week-old Leghom hens, and collected the eggs before and after the immunization. Then, we cracked the eggs and separated the yolk to extract the polyvalent egg yolk IgY by three methods (freeze-thawing method, water dilution method and PEG extraction method), and determined the titer of IgY by ELISA and western blot. The results showed all of the eggs collected during the immunization contained effective IgY that can cross-react with five snake venoms mentioned above, and the content of these IgY increased as the immune-intensity enhanced. The content of effective IgY varied by different extraction methods, and even the efficiency of IgY extracted by the same method varied while cross-reacted with different venoms, this might be attributed to the different immune response of the Leghom hen to these five venoms. This study provided data for preparation and application of efficient polyvalent egg yolk IgY against venoms from these five pit vipers.
毕业论文关键词：卵黄；多价IgY；蝮蛇；蛇毒；酶联免疫法；蛋白印迹法
Keyword: Egg yolk; polyvalent IgY; pit viper; snake venom; ELISA; western blot
目 录
1 材料和方法·4
1.1材料4
1.1.1仪器与试剂·4
1.1.2实验用蛇毒及动物·4
1.2方法5
1.2.1抗原制备及母鸡免疫··5
1.2.2卵黄IgY抽提与浓度测定·5
1.2.3 ELISA检测·5
1.2.4 SDS-PAGE和western blot检测5
2 结果·6
2.1莱航鸡产蛋情况··6
2.2 ELISA检测结果··6
2.3 SDS-PAGE和western blot检测结果7
3 讨论·8
蝮亚科毒蛇是中国分布广、资源保有量较多的类群，经常会有人被蝮蛇咬伤，这些种类涉及亚洲蝮属、竹叶青蛇属、原矛头蝮属和烙铁头属等广义蝮蛇。每当水患过后，各类蝮蛇所致蛇伤病例会明显增加，以致各地抗蛇毒血清储备告急，进而延误了部分患者治疗，如2010-2012年的长江中下游省份水患就造成了重大影响。就全国蝮蛇类致伤病例而言，主要由竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）、中介蝮（Gloydius intermedius）、高原蝮（Gloydius strauchii）、短尾蝮（Gloydius brevicaudus）、乌苏里蝮（Gloydius ussuriensis）、岩栖蝮（Gloydius saxatilis）、菜花原矛头蝮（Protobothrops jerdonii）和原矛头蝮（Protobothrops mucrosquamatus）等种类所致，其中后五种所致蛇伤的影响范围较广，基本覆盖除西北部省份以外的中国所有其它省份。
当前国内临床使用的抗蝮蛇毒血清是以短尾蝮蛇毒为抗原免疫马匹所制备的[1-2]，此类抗体的单价较贵，治疗一次蛇伤，需要近千元，因此蛇伤治疗成本相对较高。据覃公平（1998）抽样调查的结果，国内每年预计有近5万人次需要注射抗血清[3]。然而，目前临床上使用的抗蛇毒马血清存在许多不足：制备周期长，抗体纯化的要求高，流通不方便、价格昂贵，以及蛇毒血清使用过程中可能带来的副作用等，使其生产与需求之间的矛盾一直不可缓解，从而影响了抗蛇毒血清在临床上广泛应用[4-5]。因此，在不断完善和总结抗蛇毒血清制备技术的同时，新的蛇伤治疗药物的开发和研究有着极其重要的意义。