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    本研究应用人鼻咽癌细胞株CNE-2为模型，选用体内生理情况下存在的NO供体GSNO作为工具药，处理人鼻咽癌细胞总蛋白发生巯基亚硝基化，采用Biotin switch法纯化S-亚硝基化蛋白，iTRAQ标记结合LC-MS/MS技术鉴定修饰蛋白。采用GO功能分析、String分析差异蛋白质的功能和细胞中的定位。综合分析鼻咽癌细胞蛋白潜在的S-亚硝基化修饰靶点。研究结果可为寻找治疗鼻咽癌新靶点提供线索，为探索鼻咽癌治疗新方法提供理论依据和技术支撑。

    2 材料与方法

    2.1 材料

    2.1.1 细胞株

    CNE-2细胞株系由浙江医院馈赠。

    2.1.2 试剂

    改良型RPMI-1640培养液购自Thermo公司；胎牛血清购自Thermo公司；0.25%胰酶购自Gibco公司；还原性谷胱甘肽（GSH）购自上海晶纯生化科技股份有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜( DMSO) 购自美国Sigma公司；Hepes购自Solarbio科技有限公司；新亚铜树碱（neocuproine）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；NP-40购自上海碧云天生物技术有限公司；MMTS购自Sigma公司；Biotin-HPDP购自Thermo公司；SDS购自BioRad公司；抗坏血酸购自国药集团化学试剂有限公司；iTRAQ标记试剂-8 plex购自AB sciex公司；Tris购自BioRad公司；DTT购自BioRad公司；IAA购自BioRad公司；Urea购自BioRad公司。

    2.1.3 实验仪器

    超级洁净工作台购自博讯实业有限公司医疗设备厂；高压灭菌器购自美国Zealway公司；T1-SM120型倒置显微镜购自Nikon公司；电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海有限公司）；752型紫外可见分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司；酶联免疫检测仪购自Biorad公司；HF151二氧化碳培养箱购自力康发展有限公司；AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统购自上海百特科技有限公司；SIGMA低温高速离心机；Milli-Q超纯水仪；LTO Velos质谱仪购自Thermo公司；Orbitrap-Elite购自Thermo公司；超声波系统150-96购自Biosafer公司；真空离心浓缩仪购自Eppendorf公司；小胶电泳系统Mini-PROTEAN Tetr购自BioRad公司。源^自·优尔|文\论]文'网[www.youerw.com

    2.2 方法

    2.2.1 GSNO的合成（避光）

    400 mM酸化的GSH 0.4 mL（加入0.2 M HCL 0.2 mL），加入400 mM NaNO2 0.2 mL，混匀后室温反应15 min，用40% NaOH（约3-4 μL)，调节pH=7.2，避光保存于冰浴上。合成的GSNO用去离子水稀释200倍后测定在334 nm处的吸光度。所得的吸光度值与摩尔吸光系数0.767相比，然后乘以稀释倍数，即求得合成的GSNO的浓度。

    2.2.2 CNE-2细胞培养

    CNE-2细胞以含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。以0.25% 胰蛋白酶消化细胞，2-3天传代一次，细胞传代7次内取对数生长期细胞进行实验。

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