2。4。4 转化过程 14

2。6 阳性单克隆筛选 16

2。6。1 挑取单菌落 16

2。6。2  菌落 PCR 17

2。6。3 琼脂糖凝胶电泳 17

2。64 判断阳性克隆 18

2。6。5 质粒的抽提 18

2。7 质粒的大抽提 19

第三章 结果和分析 20

3。1 引物分段并进行 PCR 扩增的结果 20

3。1。1 引物设计结果 20

3。1。2 第一轮 PCR 产物检测结果 21

3。1。3 合并片段回收 22

3。2 H7N9 基因与载体的连接及转化结果 23

3。3 阳性单克隆筛选结果分析 24

3。4 质粒大抽结果 25

第四章 结论 28

致 谢 29

参考文献 30

附录 32

第一章 绪论

1。1  禽流感概述

1。1。1 禽流感

禽流感(Avianhifluenza,Al) 是由正粘病毒科 A 型流感病毒引发的一种禽类烈性传染 病。而由于禽流感病毒亚型，应变变化大，给疾病的预防和治疗带来了很大的困难。该 病在意大利首次发生 1878 次，被称为“禽瘟“。1901 年 Cenianni 和 Saranuzzi 分离出并描 述了该病的病原,认为这是由“可滤过”病原引起的。后来 Schafer 证明了该病属于 A 型病 毒。此外，由于外界环境的选择和免疫压力的存在，病毒的两个表面糖蛋白的变异频率 比较高，这也导致其抗原变异频繁，因此这为禽流感的有效防制带来了巨大的困难和挑 战。

H7N9 亚型禽流感病毒属于甲型流感中的一种。H7N9 型禽流感是全球首次发现的 新亚型流感病毒，并且也没有成型的有效疫苗推出。被该病毒感染的人均在早期出现发 热等症状。患病人群一般表现成流感样症状，重症患者病情多发展迅速，表现为重症肺 炎，严重的快速进展出现急性呼吸窘迫综合征。此前，禽流感病毒也有过感染人的报道。 此外血清学的证据也提示了我们，H4、H6 以及 H11 亚型病毒也可能感染过人。H7N9 一直以来都比较温和，只在动物间传播，也并非高致病性。此次它在人身上被发现了， 这证明这种病毒也具备了跨物种传播的能力。

这些年以来，H7N9 的基究竟因发生了什么变化，致使本来一直在动物间传播、也 并非高致病性的病毒，最终传到了人的身上？对此，研究者们还没有给出答案。流感病 毒呈现出普遍的对热敏感性，对低温抵抗力较强，65℃加热 30 分钟或煮沸(100℃)2 分 钟以上就可灭活。但病毒在较低温度的粪便中却可存活 1 周，在 4℃水中也可存活 1 个 月，对酸性环境也有一定抵抗力，在 pH4。0 的条件下都具有一定的存活能力。在有甘油 存在的情况下甚至可保持活力 1 年以上[39]。国家卫生和计划生育委员会在其官方网站上 公布的人感染 H7N9 禽流感诊疗方案。方案中指出，根据流感的潜伏期及现有 H7N9 禽 流感病毒感染病例的调查结果表明，7N9 禽流感病毒潜伏期一般为 7 天以内。

1。1。2 H7N9 禽流感

H7N9 禽流感是甲型流感的一种亚型。人感染上 H7N9 禽流感是指由 H7N9 亚型禽 流感病毒所引发的急性呼吸道传染病。