肝癌可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌（primary hepatocarcinoma, PHC）包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）与肝内胆管细胞癌（cholangio carcinoma, CC）。在我国，肝癌是危害居民生命健康的前3位最主要恶性肿瘤之一[4]。

Egr-1（early growth response-1）基因属于即刻早期基因家族（immediate early genes, IEGs）[5]。当细胞受到刺激之后，Egr-1基因能够在短时间内迅速被瞬时激活而表达，随后直接或间接地调控激活一系列下游基因的表达包括一些肿瘤抑制基因。其编码产物Egr-1在许多肿瘤细胞中表达水平较低或不表达，如乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、子宫平滑肌瘤等细胞[5-8]。Egr-1基因在一些实验中也表现出了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的作用，活化的Egr-1在肝癌细胞中可以通过调节miR675的量来上调lincRNA H19来抑制细胞的生长[9]，在Hep3B肝癌细胞中，Egr-1可诱导细胞凋亡[10]。论文网

基于上述原因，为了进一步研究早期生长反应因子1（Egr-1）参与姜黄素影响肝癌HepG2细胞增殖的分子机制，构建Egr-1的外来过表达载体，并且将pEGFP-Egr-1转染HepG2细胞，通过WST-1检测Egr-1外来过表达对HepG2细胞增殖的影响，从而为姜黄素在癌症治疗的临床应用中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1。1 主要实验材料与试剂

人肝癌HepG2细胞由生命与环境科学学院提供，大肠杆菌DH 5α感受态细胞（TransGen Biotech），pMD18-T载体（TaKaRa），pEGFP-C1 哺乳动物表达载体（Clontech）。

姜黄素（Bio Basic）。用于细胞培养的DMEM高糖培养基（Boster），新生牛血清（杭州四季青），青链霉素、PBS，胰蛋白酶（EDTA，酚红，南京凯基），DMSO（Bio Basic）和封口膜（Parafilm）。Trizol试剂（Beyotime），WST-1细胞增殖检测试剂盒（Beyotime），DEPC（BBI），AVM第一链cDNA合成试剂盒（Sangon），PCR扩增试剂盒（Sangon），，Xho I 和Hind III（TaKaRa），PCR清洁试剂盒（Axygen），T4 DNA连接酶（Fermentas），GeneTran 转染试剂（Biomiga），SanPrep 柱式质粒DNA 小量提取试剂盒（Sangon），EndoFree 质粒DNA 大量提取试剂盒（Biomiga），AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒、AxyPrep PCR 清洁试剂盒（AxyGen）、GAPDH 内参（Beyotime），SYBR®qPCR Mix（THUNDERBIRD），其余生化试剂均为国产分析纯。

1。2 实验仪器

单人双面垂直净化工作台（VS-840-2，上海博讯），移液枪，数显恒温水浴锅（DK-8D，上海精宏），CO2 培养箱（HF151，Heal Force），倒置显微镜（TS100，Nikon），THZ-C恒温振荡器（江苏太仓），酶标仪（Bio-RAD 680），全自动正置荧光DIC 显微镜及成像系统（90i，Nikon），离心机（Eppendorf，5417），分光光度计（Eppendorf，Biophotometer plus），水平电泳仪（Amersham Biosciences，EPS 301），凝胶成像系统（Tanon），电子天平（METTLER TOLEDO，PL203），常规PCR 仪（K960），荧光定量PCR仪（Roche，LightCycler®480 II），荧光定量PCR96孔细胞培养板及专用光学封口膜（Bioplastics）。

1。3 方法

1。3。1 细胞的复苏、培养及冻存

细胞复苏之前需要将冻存的细胞解冻，故要设置恒温水浴锅的温度，37℃为最适宜，同时，将超净工作台的紫外线开关打开，30min以上即可达到灭菌效果。细胞复苏时，将人肝癌HepG2细胞从液氮或者超低温冰箱中取出，迅速放入37℃水浴中并快速不停地振荡，使冻存管中的HepG2细胞及培养液迅速解冻，防止细胞损伤。接着在超净台中将细胞用移液枪转移至含有4mlDMEM培养液（其中含有10%小牛血清和1%青链霉素）的细胞培养瓶中，并将其置于37 ℃、5 % CO2的培养箱中进行培养过夜。第二天由于培养液中含有DMSO，对细胞有损伤的作用，所以需更换细胞培养液，为细胞贴壁生长提供一个良好的环境。文献综述 Egr-1基因外来过表达对肝癌HepG2细胞增殖的影响研究(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_168613.html