本论文的研究目的是通过CERS2基因的过表达为乳腺癌临床治疗提供解决措施,为治疗乳腺癌提供新思路。
1、材料与方法
1.1 选取合适的细胞株
从上海细胞库中购买需要的细胞株,即MDA-MB-453,MDA-MB-231,Bcap-37。
1.2 实时定量PCR
1.2.1提取总RNA
(1)使用Trizol试剂提取可以使用的细胞总的RNA,室温,静置5 min;
(2)每个皿中的细胞再加入1 ml Trizol,用刮刀来回刮,3-4次,放到离心管中,搅拌;
(3)按每毫升Trizol加0.2 ml氯仿,晃动15 s,室温,孵育5-10 min;,11,000 g,4 oC,离心15 min;
(4)将无色上清液移至新的离心管中,加等体积的异丙醇混合,上下混匀,用来沉淀其中的RNA,室温孵育10 min,然后离心;
(5)倒掉上清液,用75%的乙醇洗涤RNA沉淀,震荡均匀,离心5 min;
(6)在室温下,干燥沉淀5 min,注意不要让沉淀完全干燥。使用DEPC-ddH2O溶解DNA沉淀;
(6)最后用分光光度计实时定量RNA。源`自·优尔.文/论:文'网,www.youerw.com
1.2.2 逆转录反应
进行逆转录反应,目的是把RNA逆转录为cDNA。
1.2.3 实时定量PCR反应
PCR完成后,经电脑自动分析,查看每个基因的情况,计算每个基因的相对表达量,进行分析。
1.3 Western Blot实验
1.3.1 细胞中蛋白提取
按照实验要求,获取可以正常使用的细胞,用已经预冷的PBS缓冲液洗涤两次,加入适量的含抑制剂的蛋白质抽提试剂,放在冰上裂解细胞30 min。用细胞刮将培养皿上贴壁细胞刮下来,把细胞裂解液转移至离心管中,于4 oC 12,000 rpm离心 15 min,获取上清液,-80 oC的环境下保存。
1.3.2 SDS-PAGE电泳
(1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以通过查阅参考文献来进行配制,也可以使用试剂盒进行配制,最后配成12% SDS-聚丙烯酰胺分离胶。
(2)样品处理
快速混匀,然后放入干净的预置玻璃板(Bio-Rad)空隙中,在顶层加入去离子水,防止空气抑制凝胶的聚合,室温放置30 min。待分离胶完全凝固后,用滤纸将剩下液体吸净。配制浓缩胶,混合均匀,立刻加到分离胶上层。加入电泳缓冲液,在各泳道加入等量蛋白样品,用电泳仪进行电泳。
CERS2过表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_55620.html