磷酸盐吸附蛋白细菌细胞表面展示体系的构建(3)
时间:2017-03-29 20:42 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.1.4 细胞表面展示技术的应用 疫苗开发是通过在细菌表面展示特定抗原来研制减毒致弱活体疫苗与口服疫苗，是细菌表面展示技术的主要应用领域之一。目前的工作主要在大肠杆菌和沙门氏菌中进行，已构建了多种重组疫苗。Stentebjerg-Oiesen等将霍乱毒素B亚基插入大肠杆菌I型菌毛fumA基因，证实表面展示重组大肠杆菌具有明显的免疫原性；Kramer等通过构建大肠杆菌自动转运蛋白AID—I与耶尔森氏菌的热激蛋白Hsp60的74-86位氨基酸融合，在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中表达后，均引发实验小鼠的T细胞免疫反应。研究亦发现，重组菌株所表达的融合蛋白的量与所引发的活体疫苗免疫活性并不一定成正比。如Chen等将肠胃炎病毒C和A的抗原决定簇分别用MisL和987P亚基FasA为载体展示在鼠伤寒沙门氏菌CS4552上，结果发现，尽管FasA亚基融合的抗原表达量高，但MisL融合蛋白免疫小鼠时所产生的抗体较多。高水平表达的融合蛋白有时对受体菌产生较大的毒性。如lsoda等用Lpp-OmpA作为运载蛋白，在沙门氏菌中表达并展示红血球凝集素HagB的融合蛋白时，高量表达对宿主菌有毒性。近年来，利用安全的食晶级细菌或者益生菌作为疫苗展示的宿主菌受到研究人员的普遍重视，如利用乳酸菌等作为疫苗宿主菌菌[7]。 蛋白质文库与肽文库的筛选是从庞大的随机文库巾筛选出目标蛋白或肽片段，对于得到高活性的突变酶或提高抗原决定簇的免疫能力具有重要意义。将靶蛋白展示到细菌表面，不但可以利用荧光活性分选技术进行筛选，而且直接得到纯化的单克隆。Daugherty等通过在大肠杆菌表面展示scFv和进行点突变建立突变体库，再使用流式细胞仪分选系统进行筛选，建立了一种高效筛选突变文库的方法。Kim等采用DNA shuffling技术对枯草芽孢杆菌BSE616的纤文素酶基因进行改造，建证了大于1×106的文库，通过菌落形态进行筛选，得到的最优菌株的纤文素酶活性比对照高5倍。采用免疫学技术对大的文库进行筛选具有较高的效率和灵敏性。Bessette等将15个氨摹酸的肽插入大肠杆菌外膜蛋白OmpA上，构建了含有5×1010克隆的大文库，通过筛选得到7个氨基酸的保守序列，对人血清白蛋白、抗T7抗原决定簇、人C反应蛋白、HIV-1 gpl20和碱性磷酸酶等都有很高的亲和性[13]。 全细胞催化剂。对利用细菌表面展示技术发展多种功能的全细胞催化剂也进行了大量研究。Yang等利用恶臭假单胞菌外膜酯酶EstA在大肠杆菌上展示β-内酰胺酶，其重组菌生长发育正常，且表面具有酶活性；Narita等在干酪乳杆菌表面展示α-淀粉酶，其工程菌在最优化条件下72 h内消耗每克碳水化合物可产生0.81 g乳酸；Kim等报道，在枯草芽孢杆菌中展示的一种热纤文梭菌的纤文素酶活性提高了15倍。最近，在细菌表面展示脂肪酶成为新的研究热点。Lee等在恶臭假单胞菌KT2442中展示一种荧光假单胞菌的W1脂肪酶，比以同样方式展示在霞组大肠杆菌中的活性高5倍，在47℃、pH 9.0时保存l周，脂肪酶活性文持在90％以上。Jung等用INP作为运载蛋白将耐热脂肪酶11iA展示在恶臭假单胞菌GM730表面，得到350 U／g(干细胞)的全细胞水解活性，表面展示的酶在37℃时活性可以文持12 h。Lee等在大肠杆菌外膜展示芽抱杆菌的耐热脂肪酶，实验证明在50℃、pH9-10的条件下1周后，全细胞酶活性仍保留90％以上。Kobayashi把枯草芽孢杆菌脂肪酶B和米曲霉脂水解酶CutL同时展示到枯草芽孢杆菌表面，实现了在一种受体菌中展示多种脂肪酶，使得全细胞脂酶活力达到30000 U／L[12]。 全细胞吸附剂及降解剂。与传统理化处理相比，细菌表面展示的功能蛋白通过络合、 (责任编辑：qin) |