磷酸盐吸附蛋白细菌细胞表面展示体系的构建(5)
时间:2017-03-29 20:42 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
各培养基配方如下： LB液体培养基(Luria-Bertani)：NaCl 10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.2。如果是LB固体培养基则额外加琼脂糖15 g。 M9培养基：Na2HPO4•7H2O 12.8 g，KH2PO4 3.0 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2 3.0 mg，MgSO4 1.0 mM，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.2。 无机磷培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4•7H2O 0.03 g，MgSO4•4H2O 0.03 g，MgSO4•7H2O 0.3 g，酵母膏0.4 g，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.5。 LB培养基是一种培养基的名称，生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌，我们可以表达大量的外源蛋白，也可以拿到带有外源基因的质粒，工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础。 如无特别说明，大肠杆菌在37℃条件下培养。大肠杆菌转化子的筛选和重组菌的培养所用抗生素终浓度为：氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：100 ug／mL。 3.1.3试剂 (1) 主要分子生物学试剂 PCR引物由生物公司合成；限制性内切酶，Taq DNA聚合酶， X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-D半乳糖苷)，T4 DNA连接酶，DL2000 DNA分子量Marker，λHindIII DNA分子量Marker，DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒使用生工生物工程（上海）股份有限公司。 IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)配方如下：在8 ml蒸馏水中溶解2 g IPTG后，用蒸馏水定容至10 ml，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装成1 ml小份贮存于-20 ℃。 (2) 质粒、总DNA提取和转化所需试剂 溶液I：50.0 mmol／L Glucose，25.0 mmol／LTris-HCl(pH8.0)，10．0 mmol／L EDTA(pH 8.0)； 溶液II：0.2 mol／L NaOH，1％SDS； 溶液III：(每100ml)：5.0 mol／L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL； 溶液IV：饱和苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) STEBuffer：10．0 mmol／L Tris•HCl，0.1 mol／L NaCl，1.0mmol／L EDTA(pH8.0)； 1.0 mol/L Tris•HCl ( PH 8.0 )：在400ml水中溶解 60.55 g Tris 碱，加入浓HCl调节PH值至所需值。应使溶液冷至室温后方可最后调定PH值，加水定容至0.5 L，分装后高压灭菌。 100.0 mmol/L EDTA ( PH 8.0 )：在400ml水中加入15.48g乙二胺四乙酸，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的PH值至8.0，然后定容至0.5 L，分装后高压灭菌备用。 TE缓冲液：10．0 mmol／L Tris•HCl，1.0 mmol／L EDTA(pH8.0)； CaCl2：0.1 mol/L； (3) 琼脂糖凝胶电泳所需试剂 TAEBuffer：40.0 mmol／LTris—乙酸，1.0 mmol／L EDTA(pH8.0)； 溴酚蓝蔗糖溶液：0.25％(w／v)溴酚蓝，40％(w／v)蔗糖。 (4) 磷酸盐吸附实验所需试剂 磷酸二氢钾贮备溶液：称取0.7165 g已于105℃干燥过的磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于100 mL去离子水中并定容至1.0 L。 磷酸二氢钾标准溶液：含0.1 mg／mL PO43-；钼酸钠-硫酸溶液：1％(w／v)钼酸钠，10％(v／v)H2SO4。 (5) 仪器设备 紫外可见光分光光度计，高速冷冻离心机，凝胶电泳仪，紫外凝胶成像仪，干式恒温仪。 3.2方法、技术 3.2.1大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，本次实验采用了碱裂解法和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒两种方法。 挑取含pTrcHisC-inpN-gfp质粒的 DH5α菌平板单菌落，接种Amp 100 ug/mL液体LB培养基，37℃，200 r/min振摇培养过夜。 （A）使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，步骤如下： （1）准备工作。 1）检查Buffer P1中是否已经加入RNase A。 (责任编辑：qin) |