磷酸盐吸附蛋白细菌细胞表面展示体系的构建(4)
时间:2017-03-29 20:42 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
离子交换、吸收转化等机制来吸附和清除环境藿金属污染，是一种效率高、选择性好的生物净化途径，因而受到研究重视。Bae等采用合成的由(Glu-Cys)nGIy组成的植物螯合肽，在奠拉氏菌进行展示后发现，霞组菌吸附汞的能力提高了10倍以上；Kotrba在大肠杆菌表面表达合成多肽，其吸附Cd2+的能力提高1.8倍，且体内积累Cd2+、Cu2+和Zn2+的能力提高；Xu等利用OmpC在大肠杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽，结果发现每克干细胞可吸收32.0 mmol的Cd。环境中残留剧毒农药如有机磷类农药是主要的环境污染源之一。Li等用丁香假单胞菌KCTCl832冰晶核蛋白InaK的N端展示了甲基对硫磷水解酶，其水解活性比对参考文献照高8倍。Cho等运用分子进化技术对OPH进行改造后展示到大肠杆菌上，筛选得到的菌株22A1l降解甲基对硫磷的能力比野生型提高参考文献了25倍。利用INP作为运载蛋白，分别在大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面展示有机磷水解酶，所构建的重组大肠杆菌全细胞酶活性可达到0.62 U／mg细胞干重，是目前国外同类工作所报道酶活性的13.7倍以上；而重组假单胞菌表面展示的有机磷水解酶也达到0.036 U／mg细胞干重[5]。 1.2 磷酸盐吸附概述 由于大量含磷污水的排放造成了水体富营养化，因此污水流入环境之前必须通过污水处理的方法，将含磷化合物去除。污水中的磷通常以磷酸盐，聚磷酸盐和有机磷的形式存在，聚磷酸盐在酸性条件下可水解为磷酸盐，有机磷酸盐也可被水中细菌生物酶作用下转化成磷酸盐，因此，磷酸盐的去除是污水除磷的关键。现阶段，污水中磷的去除有多种方法，如化学除磷，人工湿地系统，生物除磷等。生物除磷是目前广泛采用的高效除磷方法，但生物获取磷酸盐需要通过环境摄取，跨膜运输等过程，每个细胞的利用度有限。此外常用的强化生物除磷技术在有氧、高碳和低COD条件下除磷效果低[2]。 磷酸盐吸附蛋白（PBP）是细胞周质蛋白，是参与大肠杆菌PST系统磷酸盐吸附运输的蛋白质之一。PBP的编码基因为phoS，是负调控基因，有自己的启动子，在细菌细胞磷饥饿状态下诱导表达。phoS编码的氨基酸序列是PBP前体，N末端含有25个氨基酸残基的信号肽序列，通过ABC（ATP-binssette）转运系统帮助PBP蛋白转运至细胞周质。成熟的PBP蛋白包含321个氨基酸残基，分子量大小约为34 kda。PBP蛋白不仅可作为生物传感器检测磷酸盐。还可用于吸附水中的磷酸盐，达到净化的目的。Kuroda等将铜绿假单胞菌的PBP蛋白纯化后固定于具N-羟基琥珀酰亚胺活性的琼脂糖凝胶上，置于层析柱中，含磷酸盐的水通过层析柱，磷酸盐因被PBP蛋白吸附而从水中去除。然而，这种方法成本高，费时费力，显然不利于实际应用[1]。 2 本课题的研究目的和意义 磷酸盐吸附蛋白可作为生物传感器检测磷酸盐。还可用于吸附水中的磷酸盐,达到净化的目的。本实验以冰晶核蛋白N末端结构域为载体蛋白，构建的细胞表面展示体系在大肠杆菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白。磷酸盐吸附蛋白的展示弥补了强效生物除磷技术在有氧、高碳和低COD条件下磷吸附效果低的不足，提高了磷酸盐吸附量，大大缩短了反应所需时间，为污水除磷提供了又一新方法。 3材料试剂、仪器设备和方法、技术 3.1材料试剂、仪器设备 3.1.1菌株与质粒 菌株：E.coli DH5α、E.coli JM109、MB108(含质粒pMB102的JM109菌株)。 质粒：pTrcHisC，pMB102（pTrcHis-C插入inaQ-N/gfp融合基因）。 3.1.2 培养基配方及培养条件 本研究中E. coli DH5α、E. coli JMl09及重组菌的培养用LB培养基。重组菌的磷酸盐吸附实验用无机磷培养基。 (责任编辑：qin) |