T7RNA聚合酶的合成与表达+文献综述(3)
时间:2017-05-17 22:00 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2 T7 RNA 聚合酶简介 T7RNA聚合酶（英语：T7 RNA Polymerase）是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。在体内T7 RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列，转录效率很高[10]。 此酵素在合成RNA的过程中，需要DNA模板与镁离子（Mg2+）作为辅因子。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及精胺（spermidine）对此酵素具促进效果。与细菌的RNA聚合酶的差异之一，在于T7 RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素（rifampicin）抑制。 1.2.1 T7 RNA聚合酶的结构 T7 RNA聚合酶最初是被从T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的[20]。T7噬菌体是一种中等大小的噬菌体，其线状双螺旋DNA由39 936bp组成。T7噬菌体编码的唯一RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，其编码基因长度为2 652bp[21]。 T7 RNA聚合酶从结构上看与一个包含有单亚基DNA聚合酶和RNA聚合酶的核苷酸聚合酶家族有关。X光研究已经表明， T7 RNA聚合酶的和许多DNA聚合酶的三文结构之间存在着一个明显的相似性（图1）[22，23，24]。因此，T7 RNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I的克莱诺片段在结构上表现出了非常高的相似性：当这些酶发生聚合作用的区域叠加时，这两个结构上所有的α-螺旋和β-链（除了一个）都是彼此互补的。在这些区域的形状类似于一个人右臂（并且包含“手掌”，“拇指”和“手指”）[24]，而由亚结构域所形成的深沟状结构是对DNA模板的结合位点。 1.2.2 T7 RNA聚合酶与启动子的相互作用 RNA聚合酶识别的启动子由高度保守的23个碱基序列组成。保守序列跨越转录起点(﹢1)并从﹣17延伸至﹢6[26]。T7启动子明显由两个功能点组成：结合（﹣17到﹣6）和启动（﹣6 到﹢6）。前者的突变导致在启动速度无明显影响的情况下T7 RNA聚合酶的亲和力减少了，而后者的突变虽然对酶的影响很弱，但对RNA的合成有极大的影响[23]。 在体内T7 RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列，转录效率很高[27]。 2 实验原理 2.1 构建带有T7启动子及his标签基因的质粒 pET-29a-c(+)载体携带一个N末端S•Tag™凝血酶构型，此外还有一个可供选择的C末端组氨酸标签序列。这些独特的位点显示在下面的图中。本图通过pBR322定律来进行数字标记，因此T7表达区域在图中发生了颠倒。通过T7核糖核酸聚合酶编码链转录的克隆表达区域显示在下面。调整f1起始端以便影响辅助噬菌体产生包含单链DNA病毒，这相当于编码链。因此，单链序列要使用T7终止子引物来操作。 图2 pET-29a(+) 图3 pET-29a(+)基因序列图 2.2 细胞破碎 微生物代谢产物大多数分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但是有些目的物存在于细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取[27]。近年来常用的细胞破碎方法有以下几种：(a)高压匀浆法；（b）高速珠磨法；（c）超声破碎；（d）酶溶法；（e）化学渗透法；（f）液氮研磨破碎法[28]。根据本实验要求选用液氮研磨破碎法。 液氮即液态氮气，为无色透明、无、无毒的低粘度的透明液体，不导热不导电，不自燃助燃，化学性质稳定，不与任何物质起化合作用。1单位体积的液氮可产生约650倍体积的氮气[29]。液氮的温度为-196℃，它既能使各种组织成分不易被破坏或降解，又能使组织变硬，脆性增加易于磨碎。 (责任编辑：qin) |