T7RNA聚合酶的合成与表达+文献综述(4)
时间:2017-05-17 22:00 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
液氮研磨法破碎细胞主要是利用液氮从液态转变为气态时可产生-112℃的低温这一特性，在加工物料时将液氮喷洒在物料的表面，使其温度在8秒内能急降至-70℃左右，从而使物料的物理性能(如脆性、韧性等)发生改变，这样，就使物料变得更加容易粉碎[30]。 2.3 Ni柱亲和层析纯化 蛋白质（酶）的纯化可根据不同的性质使用不同的方法，主要从以下几方面性质进行分析：①根据分子大小不同，纯化方法包括：透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤；②根据溶解度差别不同，纯化方法包括：等电点沉淀和pH控制、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶解分级分离法；③根据电荷不同，纯化方法包括：电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析；④利用选择性吸附的原理纯化方法包括：羟磷灰石层析、疏水作用层析；⑤利用对配体的特异生物学亲和力的原理纯化；⑥高效液相层析以及快速蛋白质液相层析。 根据本实验要求选择利用对配体的特异生物学亲和力原理进行纯化。亲和层析（affinity chromatography）是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。它只需要进过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。 亲和层析的基本原理是把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基（如-OH）上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适合的连接臂或称间隔臂（Spacer arm）如ε-氨基酸，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合。这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过。当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他的蛋白质（称杂蛋白）则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来（称亲和洗脱）[31]。 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质。如酶和底物、抗原和抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲和作用。而亲和层析则是一种利用该性质进行的特异层析分离技术，它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高[32]。 镍柱亲和层析法是利用6组氨酸标签作为亲和纯化标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱酸性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱[32]。 图4 Ni柱纯化原理图 2.4 蛋白质电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，缩写为PAGE）是以聚丙烯酰凝胶作支持介质的一种电泳方法。它使蛋白质分离的效应有三个，一是电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同；二是分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同；三是凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是由丙烯酰胺单体（Acrylamide简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N•N'-methylena Bisacrylamide简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三文网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法，亦称为化学聚合或光化学聚合法。化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称AP）。在催化剂N，N，N'，N'-甲基乙二胺 （Tetramethylenediamine 简称TEMED）的作用下，由AP形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低pH下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。光聚合以核黄素（VB2）作为催化剂（可以不加TEMED），在痕量氧的存在下，光照起动核黄素光解形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加。若在光聚合时加入TEMED可以加速聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随时间延长逐渐变小，不太稳定，所以用它来制备大孔径凝胶较合适。采用过硫酸铵-TEMED化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。氧抑制聚合反应，因此凝胶混合物在聚合前需要脱气。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。 (责任编辑：qin) |