表 1。1  肽和蛋白质分离纯化的方法

方  法                               评    论

反相HPLC                    最广泛应用于分离肽和蛋白质的HPLC，适于评估肽的不均一性

离子交换色谱                  蛋白质纯化的最常用方法

分子排阻色谱                  主要基于分子大小的分离。大分子先于小分子被洗脱下来 

亲和色谱                      用化学方法连接于惰性载体上的选择性配体，将与之有亲和性的靶组分附着分离

毛细管电泳                    基于肽和蛋白质在电场中迁移的差异进行的分离

多维分离                      2D胶电泳和多维色谱方法可更精确地定量分析样品，与质谱更兼容

超滤                          蛋白质溶液的快速浓缩方法，由于其缺乏选择性，严重限制了其在蛋白质分离的应用

蛋白质分离纯化的两相系统      在含聚乙烯基乙二醇和疏水性修饰的葡萄糖的水性两相系统中，蛋白质的疏水性分配。

1。2 HPLC简介

1。2。1 HPLC的起源与发展

色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法从二十世纪初发明以来，经过几代科学家的不断发展，如今广泛地应用于许多领域。俄国植物学家Tswett是“色谱学之父”。

高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有高效、高灵敏度、分析速度快、应用范围广等优点，是多肽分离纯化的重要方法。

1。2。2 HPLC分离原理

反相高效液相色谱的固定相是非极性的反相介质，流动相是极性有机溶剂或其水溶液，根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。主要用于分离纯化分子量低于5000的非极性小分子多肽，一般采用降低流动相极性的线性洗脱梯度法。反相高效色谱法具有十分高的分辨力，它的分离对象很多，几乎包括所有不同类型的化合物。它既可用于分析型实验，又可以用于制备分离。

1。3分析型HPLC和制备型HPLC 论文网

分析型HPLC色谱柱直径较细，色谱柱内填料颗粒较小，进样量少，组分在固定相和流动相的平衡浓度呈正比关系，吸附（分配）等温线为一条直线。分析型色谱基本上是在线性色谱范畴下工作，色谱峰符合高斯分布函数。制备型HPLC色谱柱直径较粗，色谱柱内填料颗粒比较大，进样量大。根据进样量的多少，制备色谱可以分为三类，进样量为毫克级的称谓半制备型色谱；进样量为克级的称为制备型色谱；进样量为千克级的称为大规模制备色谱。在制备色谱中，分离的样品都比较多，通常的进样量都较大，故样品在流动相与固定相中的浓度关系不再是一条直线，即样品在流动相中的浓度与样品在固定相中的比例不再是正比关系，其吸附（分配）等温线会发生弯曲。色谱流出的峰型是不对称的，色谱峰保留时间也随样品量的大小而发生变化是非线性色谱的特点。但其优点是可以高纯度大量廉价的获取样品中的目标成分。在实际生产中，

分析性HPLC用于优化样品分离纯化的方法 ，而制备性HPLC用于生产环节，大批量纯化样品。