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2。2 实验方法

2。2。1 引物设计

依据PCR反应的原理，模板DNA高温发生变性成单链，接着在DNA聚合酶的作用下，进行链的复制，但是从哪里开始复制并不确定。这时引物就可以一个引导片段作为单链复制的起始点，让PCR能够顺利地进行下去。所以实验具体的操作前我们首先要获得研究对象目的基因的序列，然后根据目的基因进行引物的设计。利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）资源平台，查询到大肠杆菌OmpC的编码蛋白的DNA序列，长度为1104 bp，然后根据序列上的酶切位点，结合以下引物设计原则进行引物设计。文献综述

引物设计需要遵循的原则：

① 引物长度在15-30 bp，一般在20 bp左右；

② GC含量一般在40%-60%之间，如果太少会使得扩增效果不好，太多易出现非特异条带；

③ AGCT最好随机分布，尽量避免5个及以上嘌呤或者嘧啶核苷酸成串的出现；

④ 引物内部不可出现互补序列；

⑤ 引物前面一般加上3个保护碱基。

2。2。2 提取基因组

DNA是遗传信息的载体，它是十分重要的生物信息分子，也是分子生物学的主要研究对象，所以基因组DNA的提取是分子生物学实验中最首要的，最基础的操作。DNA的提取的原则是既要使DNA能够与蛋白质，脂类和糖类等大分子分离，又要保证DNA不被破坏。

① 基因组DNA的提取步骤：

1。接种大肠杆菌（直接在之前准备好的平板上用经过灭菌的牙签或者枪头挑取一个大肠杆菌的单菌落），将其加入到25 mL的LB液体培养基中，在37 ℃摇床中孵育12 h左右。

2。取2 mL细菌杆液，在5000的转速下离心大约1 min，把上清液倒掉。

3。重复上述步骤一次（用以增加菌液的浓度）。