1。2 ITO导电玻璃的封闭处理

NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，塞进了很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合[7-9]。因此对ITO导电玻璃进行封闭处理主要是为了抑制ITO导电玻璃膜上的非特异性的吸附，从而提高其特异性的吸附。

通过查阅文献《基于ITO的单分子检测及其应用于电转印技术的初步探讨》[10]了解到封闭液对消除非特异性吸附是有明显效果的，对此现象进行探究，以求寻找到最佳的封闭条件来抑制非特异性的吸附。

2 实验部分

2。1仪器

超声清洗机,电热恒温培养箱型，烘箱，真空干燥器，真空泵，全内反射荧光显微镜系统[11]，主要包括倒置荧光显微镜，卤素灯倒置荧光显微镜控制单元，multi-Ar激光器，EMCCD[9]，精密净化交流稳压电源，精密光学隔振平台，超滤离心机。

2。2材料与试剂

ITO导电玻璃，丙酮，乙醇，二次水，硅烷化试剂N-(3-Dimethylaminopropyl)-

N-ethylcarbodimide hydrochloride，量子点(Qdot585 ITK)，蛋白(Trvpsin 2。8 kDa)，NaCl，EDC，混合纤维素酷微孔滤膜（孔径0。22 μm），盖玻片，无菌注射器。

BBS缓冲液(pH7。4, 10 mM)：称取相应质量的硼酸，溶于20 mL的二次水中，然后用NaOH溶液将其pH调至7。4，然后加二次水至50 mL,配制成浓度为10 mM的BBS缓冲液，4 ℃下保存。

BBS缓冲液(pH8。3, 50 mM)：称取相应质量的硼酸，溶于20 mL的二次水中，然后用NaOH溶液将其pH调至8。3，然后加二次水至50 mL,配制成浓度为50 mM的BBS缓冲液，4 ℃下保存。

PBS缓冲液(PH8。0 50mM)：称取PBS 0。9655g，溶于20mL的二次水中，然后用NaOH溶液将其PH值调至8。0，然后加二次水至50mL，用0。22μm的过滤器过滤，配制成浓度为50mM的PBS缓冲液，4℃保存。文献综述

PBS缓冲液(PH8。0 10mM)：用移液枪移取10mL PH8。0的PBS，然后加入40mL的二次水将其稀释5倍，配制成浓度为10mM的PBS缓冲液，4℃保存。

PBS缓冲液（NaCl）：称取0。09gNaCl,溶于10mL的50mM PH8。0的PBS缓冲液中，4℃下保存。

BSA封闭液：1%（w/v)的小牛血清白蛋白（BSA）封闭液，称取0。005g小牛血清白蛋白溶于500μL的PBS（NaCl）缓冲溶液中。封闭液一般都是现用现配的。

2。3 ITO导电玻璃的清洗

将待硅烷化的ITO导电玻璃先用丙酮超声15min，然后再用乙醇超声15min，最后用二次水超声15min，之后把清洗过的导电玻璃放到烘箱里烘干。

2。4 ITO导电玻璃的活化

活化洗液是由H2O2，NH3。H2O和H2O溶液混合而成的，活化主要是为了突出Si-OH。活化的步骤是先把导电玻璃浸泡在活化洗液中超声5min，然后再进行1h的水浴，再用二次水进行3次超声，每次超声10min，之后就是把导电玻璃放入烘箱中烘干2h（烘箱温度为180℃），保证其表面没有水分残留。

2。5 硅烷化处理

将烘干的ITO导电玻璃放在真空干燥罐中冷却到室温，同时在真空干燥罐中放入干燥剂，确保绝对的干燥。然后取出硅烷化试剂，硅烷化试剂使用前必须要升到室温才能使用，所以使用前要提前取出升到室温。当ITO导电玻璃冷却到室温时，打开真空干燥罐将干燥剂取出，用移液枪移取200μL以升到室温的硅烷化试剂，迅速的将其移到存放ITO导电玻璃的器皿壁上，然后将硅烷化试剂密封好，再将真空干燥器密封好。接着就是把泵和真空干燥器连接上，将真空干燥器上方的放气阀门打开，打开泵开始抽真空，持续4-5min，发现泵排气口不在冒出白烟就将真空干燥器上的放气阀关上，等待1-2min，再讲放气阀打开，看看有没有白烟从泵排气口冒出，没有就把泵关掉。关泵前要先关掉泵的电源再把真空干燥器的连接口拔掉。最后将真空干燥器放置在除湿机前，进行隔夜处理。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-