参 考 文 献 23

1  引言

1。1  生物膜介绍

生物膜是所有细胞的结构基础，在细胞的生命活动中扮演着不可或缺的角色，是其能够有条不紊的进行生命活动的重要保证[1]。生物膜的流动镶嵌模型认为，膜是由磷脂双分子层构成，亲水头在外，疏水尾相对。磷脂双分子结构阻止了水、盐离子等物质随意进出细胞,因此物质进出细胞需要额外的通道。

1。2  膜蛋白研究现状

1。3  质粒与表达载体

要制得OmpF膜孔蛋白进行研究，首先需要从大肠杆菌中获得OmpF的目的片段，并通过分子生物学技术构建表达载体。近年来,伴随着基因工程、蛋白质工程等科学技术手段的发展以及众多高科技分析仪器的产生，体外构建表达载体变得更加便捷。

质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是一种能够在细胞染色体外进行自我复制的环状双链DNA分子。载体是指能把一个目的DNA片段通过DNA重组技术转移到受体细胞并且能进行自我复制的DNA分子，它是一种运输工具。质粒是重组DNA技术中常用的载体。表达载体上含有复制原点，启动子以及终止子，有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。携带外源基因的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如卡那抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

1。4  表达纯化与质谱分析文献综述

亲和纯化是蛋白质纯化中最常用的策略，多聚组氨酸标签是最常用的亲和标签之一。多聚组氨酸能够与金属离子，如亲和柱上的Ni2+结合，再通过高浓度的咪唑冲洗，得到初步纯化的目标蛋白。通过人为的在N端添加六个组氨酸标签，目标蛋白的纯化变得更加简单。

随着近些年质谱技术的发展，特别是非变性质谱一系列研究和方法学探索，为膜蛋白的研究作出了重大贡献[5]。近年来，软离子化方式的出现极大推动了质谱技术在大分子结构功能分析上的发展。通过ESI和MALDI等软离子化方式，被去污剂包裹的膜蛋白和其复合物可以完整的从液相转移到质谱气相真空，结合Time-of-Flight（TOF）质量分析器，其分子量可以被准确测量。

2 仪器和材料

2。1 仪器

本实验用到的实验仪器以及型号见表2。1。

表2。1 实验仪器名称、型号以及生产厂家

2。2 材料

2。2。1 质粒

载体pET28购买于Invitrogen。

PCR引物由生物生工（上海）股份有限公司合成。

2。2。2 菌种

大肠杆菌DH5α是用于克隆质粒的宿主细胞，大肠杆菌BL21（DE3）是用来表达融合蛋白的宿主细胞。

2。2。3 工具酶和试剂盒

FD Nde I、FD EcoRⅠ等限制性内切酶购自Fermentas；dNTP、10×PCR buffer、rTaq酶、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase buffer等均购自大连宝生物有限公司。小量提取质粒和DNA凝胶回收试剂盒购于康宁生命科学（吴江）有限公司；PCR产物回收和基因组提取试剂盒购于天恩泽公司。来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

2。2。4 试剂

本实验所用的试剂见表2。2。

表2。2 实验用试剂、规格及实验厂家

2。2。5 缓冲液及其他常用试剂配制

（1）50×TAE电泳缓冲液

【组分浓度】

Tris 碱                 242。0g

二水合乙二胺四乙酸钠   37。2g

冰醋酸                 57。1mL