N-琥珀酰壳聚糖的荧光素标记反应研究(3)
1.32 壳聚糖/DNA 载体的稳定性
研究发现，在水中储存交联的DNA/壳聚糖， 纳米微粒可以保持稳定3 个月以上，而在同样条件下储存在PBS 中的未交联纳米微粒仅仅能保持稳定几小时。冻干的DNA/壳聚糖载体微粒可以文持其效力达4 周以上。由于由非病毒性载体运载的DNA 很易受DNA酶 降解的影响，因此检验DNA 运载体系的一个标准参数就是载体物质防止DNA酶降解、保护结合在载体上的DNA 的能力，由于酶的生理浓度无法准确检测，只能人为估计，Richardson 等以DNaseⅠ和Ⅱ作为标准酶，在不同酶浓度下通过凝胶电泳来检验载体的保护能力，发现由不同分子量(<5000D, 5000～10000D, >10000D)且经高度纯化的DNA与壳聚糖组成络合物，在加载率为1/1 时几乎可以完全抑制DNA酶Ⅱ对质粒DNA 的降解。简而言之，壳聚糖完全有能力有效地保护DNA，防止酶对其的降解，究其原因可能是由于壳聚糖与DNA 结合而成的络合物所形成的三文空间结构所产生的位阻影响。
1.33 壳聚糖/DNA 载体的转染能力
将包埋小牛胸腺 DNA的壳聚糖-海藻酸钠微囊通过管饲法注入小鼠体内后 ，发现微囊通过小鼠消化系统仍能回收 ，说明壳聚糖-海藻酸钠微囊可作为DNA的保护屏障 。利用壳聚糖可浓缩 DNA，且形成小的分散颗粒 (最大粒径为100 nm)，将壳聚糖-DNA复合物用于基因运载，经验证壳聚糖-DNA 复合物能有效转染HeLa 细胞(宫颈癌传代细胞) 【12】。Sato 等对壳聚糖特征及其吸收率研究表明，除了较低的摄取效率，壳聚糖-DNA转导A549细胞时远远优于聚半乳糖胺/ DNA复合物。因为在溶液中壳聚糖分子带大量正电荷，能与质粒 DNA 形成50~200 nm 粒径复合物， 使DNA分子免受破坏。与聚乙二醇 (PEG)等非生物降解的材料相比，此复合物是非常有效的体外或体内基因转运系统。Roy 等用壳聚糖-质粒DNA 纳米球对小鼠进行口服接种，结果表明转导基因在小鼠小肠上皮中表达，诱导产生分泌性IgA 和血清 IgG抗体。接种DNA 疫苗纳米球的小鼠和不接种或接种裸 DNA的小鼠相比，与过敏反应相关的 IgE水平、血浆组胺水平和血管渗透性显著降低。说明核聚糖/DNA 复合物的转染能力很高【13】。
1.34 壳聚糖及其衍生物转染效率
最近几年，人们已经报道了不少关于壳聚糖 及其衍生物转染的研究Maclanughlin 等已经研究了壳聚糖及低聚糖浓缩、传输COS-1 细胞的质粒 DNA 的能力，分子量在 100 000 以下的壳聚糖可以形成大小在 100～200nm 范围内的微络合物，且在 10%的血清中检测到这些络合物，这些络合物显示了不同的稳定性。经研究表明，在体外环境中，壳聚糖的分子量对质粒的表达影响甚少；在兔子小肠的体内试验中，壳聚糖/DNA 络合物中质粒的表达水平比没有保护的裸露质粒的表达水平高得多.Ishii 等发现，当壳聚糖的分子量在 40kD 或84kD、N/P 比为5、pH为7、转染培养基含有10%的血清时，壳聚糖/DNA 络合物的转染效率最好【14】。
1.4 研究课题的提出和内容
1.4.1 研究课题的提出
壳聚糖有如此多的有点和广阔的应用前景，但是壳聚糖的溶解性不好，只能溶于酸溶液中。为增加壳聚糖的溶解性和细胞亲和性，先将壳聚糖的氨基进行琥珀酰化，制成琥珀酰壳聚糖。为跟踪和检测琥珀酰壳聚糖对细胞的亲和性强弱，以及在细胞内的动向和分布情况，就必须对琥珀酰壳聚糖进行标记。由于合成的载体作用于细胞，所以载体的毒性应尽可能小，经研究发现，异硫氰酸荧光素的毒性小，适用于细胞实验。所以本课题组决定采用异硫氰酸荧光素标记琥珀酰壳聚糖，本文的重点研究内容之一就是探索异硫氰酸荧光素与琥珀酰壳聚糖反应的反应条件，提高荧光标记率。通过测定A549、H460和MCF-7三种肿瘤细胞对琥珀酰壳聚糖的摄取率来挑选琥珀酰壳聚糖载体的适用靶细胞。
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