生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(4)
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2.1.2培养基及实验试剂
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢所需的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，所以对营养物质的要求也各不相同，通过对酵母代谢的研究和筛选确定酵母发酵产2-苯乙醇的培养基如表2-2所示：
表2-2 培养基配方
Table 2-2 medium formula
配比 含量
Mg2SO4 0.5%
K2HPO4 0.5%
L-phe 1%
NaCl 0.1%
葡萄糖
活性干酵母 3%
1%
2.2方法
2.2.1实验方法
通过单因素试验和Plackett-Burman试验对较多因素进行研究的基础上将对实验有显著影响的因素进行响应面分析建立数学模型和回归方程，最终确定最优的提取条件。以下是本实验采用的实验方法：
(1) 单因素法
单因素法是实验中只有一个影响因素，或虽有多个影响因素，在安排实验时，只考虑一个对指标影响最大的因素，其它因素尽量保持不变的实验，即为单因素实验。其优点为能够较明显的检查出单个因素对实验的影响，但是工作量巨大，话费大量的人力物力。本实验利用单因素法对辅酶提取过程产生影响的因素进行检测，确定他们的影响程度，方便下一步实验的进行。
(2) Plackett-Burman（PB）方法
PB设计法就是筛选试验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著性，采用的试验设计方法。方法主要通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。筛选试验设计不能区分主效应与交互作用的影响，可以确定显著影响的因子，从而达到筛选的目的，避免在后期的优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源。PB实验设计法广泛应用于微生物发酵培养基成分的优化和发酵工艺关键参数的筛选，能有效筛选出对目标值影响最大的关键因素，节省大量的人力物力，为下一步的响应面实验建立做准备。
(3) 响应面分析法 （Response Surface Methodology, 简称 RSM）
响应面分析法是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，是一种优化工艺条件的有效方法。同时响应面图能比较直观的反映各因素和各因素间的交互作用。本实验通过文献和实验经验的累积选择可能影响细胞内辅因子NAD+、NADH提取的影响因素，并在单因素试验结果的基础上通过Plackett-Burman设计从众多影响因素中筛选出显著因素为响应面的实验设计选出关键的因素，从而优化酵母细胞内辅因子NAD+、NADH的提取工艺。检测方法采用HPLC方法检测提取液中辅因子的含量。
2.2.2分析方法
响应面和Plackett-Burman设计采用Design expert8.0.5软件进行设计实验，采用SPSS17.0进行数据处理分析，并利用origin7.5作图。
3实验条件优化
3.1单因素实验
NADH/NAD+是细胞内的辅因子，大部分存在于线粒体内，分离提纯这类产物时，必须将细胞壁破碎或改变细胞壁通透性使产物得以释放。因此细胞破碎是提取的关键性步骤。目前，细胞破碎的方法很多，有机械法，如珠磨法、高压匀浆法、超声波法等和非机械法，如溶酶法、渗透压冲击、冻结和融化、热处理、化学渗透法等。实验结合实验室的现实条件选取其中的几种可行的方法通过实验分析其提取得率。