生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(8)
实验采取色谱条件为：进样量5ul，检测温度30℃，流速：1ml/min，DAD检测器波长：260nm和340nm(NADH在此波长下有特征吸收）。流动相A为：10mM的KH2PO4，10mM的四丁基氢氧化铵和0.25%甲醇；流动相B为100mM的KH2PO4，2.8mM的四丁基氢氧化铵和30%甲醇。采用梯度洗脱，洗脱设置条件为B流动相4min内由0%到60%，30分钟达到75.6%。
按色谱条件测定标准样品和实验样品，如图标准样品NAD+、NADH的色谱图和实验样品的色谱图进行比较，NAD+、NADH的峰形较好，可准确测定其峰面积，并以峰面积进行定量分析。通过出峰时间可以定性而通过峰面积可以对辅酶进行定量。
图3-1 标准样品色谱图
Fig.3-1 The chromatogram of Standard sample
图3-2 样品色谱图
Fig3-2 The chromatograms of sample
3.4.2 酶循环法
酶循环法是采用两种工具酶进行的循环反应，使被测物放大扩增，从而提高检测灵敏度的酶学分析方法. 因为NADH有较强荧光。而NAD+的荧光较弱，所以NADH自身荧光信号的变化能够反映出细胞内代谢水平的变化，但是细胞内NADH的含量很低，因此其吸收光谱和荧光光谱信号很弱。由于NAD+参与了生物体内300多种酶的氧化还原反应，而且采用酶法测定具有特异性好、检测简便、反应温和、无污染、灵敏度较高等优点。
循环酶测定方法：即6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶的催化特性及酶偶联反应的原理，使反应体系中NADP-NADPH 循环变化，对循环中生成大量的6-磷酸葡萄糖酸，用指示酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化，检测终产物NADPH，从而提高检出能力。
图3-1 酶循环荧光法测定原理图
Fig.3-1 The principle diagram of the enzyme circulation fluorescence spectrometry
3.4.3 试剂盒法
辅酶Ⅰ（NAD+）包括还原型（NADH）和氧化型（NAD+）两种类型。NAD代谢包括NAD+的合成与降解、NAD+/NADH的还原与氧化和NAD+磷酸化生成氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）。近年来发现NAD+的合成和降解及其产物参与细胞凋亡、钙离子稳态和基因表达的调控。NAD+主要通过糖酵解-三羧酸循环（EMP-TCA）还原生成NADH，后者通过呼吸电子传递链氧化再生为NAD+。因此，NADH/NAD+比值是EMP-TCA和呼吸电子传递链的重要调控因子。比值高将抑制EMP-TCA，同时促进呼吸电子传递链；相反，比值低将促进EMP-TCA，同时抑制呼吸电子传递链。可见，NADH/NAD+比值与ATP合成和呼吸耗氧量密切相关。NADH氧化是活性氧（ROS）的主要来源， 包括沿着呼吸电子传递链传递时电子渗漏和发生在细胞质膜上NADH直接氧化产生的超氧阴离子两种途径。此外，NAD+激酶催化的NAD+磷酸化，是辅酶Ⅱ（NADP+）的唯一来源。总之，NAD+代谢与能量代谢、ROS代谢、NADP+代谢密切相关，而且在细胞凋亡、信号传递和基因表达调控中具有重要作用，已经成为生命科学和医学的研究热点。
NAD+是糖酵解和TCA循环的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD+含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD+及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物具有非常重要的调控作用。
试剂盒法的原理为：NAD+和NADH在254 nm下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。实验所需的实际按照说明书配置准备齐全。
实验过程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1）混合，加入等体积的酸洗玻璃珠于旋窝振荡器上震荡30s，冰浴30s，反复10次后置于冰浴中超声20min，300w，超1S停2S于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，液相检测。