1。2 植物对低温的响应

为了更好地适应低温环境，植物在长期进化过程中进化出低温驯化响应保护机制。低温驯化是指植物在寒冷环境中生存一段时间后可以获得比之前更强的抗寒能力。在低温驯化过程涉及到多种基因的诱导表达，研究及鉴定其功能一直是冷驯化研究的主要目标[7,8,9]。

HAP转录激活因子是一类低温诱导的反式作用因子，在拟南芥中被首次发现。它可以特异性结合CRT/DREDNA调控元件，推动多种启动子中含有该调控元件的冷诱导基因的表达，从而激活植物的抗逆性机制。HAP基因家族包括HAP1、HAP2、HAP3、HAP4四个基因。

研究表明HAP1、HAP2、HAP3均在定位在拟南芥4号染色体的短臂上，而HAP4则定位在5号染色体上[10，11]。最近研究表明，4种HAP蛋白都含有相同的结构基序，即AP2结构域。AP2是一种植物特有的DNA结合结构域，含有约52-70个氨基酸残基，也存在于拟南芥APETALA2、IBTEGUMENTA、TINY等植物蛋白中。 AP2结构域的作用是与HAP基因下游COR基因启动子中的CRT/DRE片段结合，诱导植物对非生物逆境因素的响应。

当处于低温胁迫条件下，植物体内的HAP基因转录水平能在短时间内迅速提高，一段时间后（约2h），含有CRT/DRE元件的一组COR得以表达。在含有四种HAP基因的拟南芥转基因植株中，不需要低温刺激即可激活含有CRT/DRE元件的靶基因表达，从而植株的抗冻性提高。

自1997年发现HAP1基因以来，有关该基因的研究越来越多也越来越深入。Gilmour等在2000年证明了HAP3诱导拟南芥中脯氨酸、可溶性糖含量及其抗冻性的增加。严海燕和 Steponkuspl的研究表明，过量表达HAP3可导致与抗冷适应一致的细胞膜膜脂含量的增加及相关组分磷脂、甾醇组成的变化[12]。这些结果证明了HAP基因家族在冷适应过程中的关键性作用，也暗示该基因家族在植物抗冻、南方植物北移，换季节种植等基因改良品种方面的重要价值和广大市场前景。

1。3 本研究的目的意义

本实验为了获取目标基因的超表达植株，将HAP基因基因全序列插入超表达载体pB7WG2D的多克隆位点得到重组载体pB7WG2D-HAP，将其转化入农杆菌，运用花序浸染法将携带目的基因的农杆菌转化入受体材料拟南芥中。然后通过喷洒Baste溶液进行突变体筛选，最终得到拟南芥HAP基因超表达突变体。将所得突变体种子保存下来以便进行后续实验，为进一步了解植物对低温的响应、如何更有效的利用HAP类转录因子提高植物的非生物胁迫抗性提供理论和科学依据奠定良好基础。文献综述

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1 实验材料

农杆菌转化材料为野生型哥伦比亚拟南芥；农杆菌为LBA4404，真核超表达载体为pB7WG2D。

2。1。2 材料处理

配置拟南芥培养土，装于6cm*6cm小花盆中（方形），置于盛水的托盘中。种子置于4℃春化2-3天使出苗整齐。春化好的种子均匀撒在泅好的培养土表面，盖上盖子，等发芽即可移去。设定培养箱为22℃，空气湿度为80%，每天光照16h，黑暗8h [20]。

2。1。3 主要试剂

NaCl，HCl， NH4NO3， EDTA， NaOH，Loading Buffer，1M Tris-HCl， 异丙醇，异戊醇，三氯甲烷，甲苯,，苯酚，甲醇，冰醋酸，磷酸，无水乙醇， 70%乙醇，蔗糖，葡萄糖，烟酸，磺基水杨酸，硫酸，甘氨酸，肌醇，L-脯氨酸，胰蛋白胨，酵母提取物，,Trizol试剂，琼脂糖，各种引物(PCR)等。