高等植物在种子成熟过程中都合成大量的储藏蛋白,几乎占种子蛋白含量的80%。这些储藏蛋白在粗糙内质网上合成前驱体,然后被运输到液泡,并在那里转换为成熟形式。在ER核糖体上合成液泡型和分泌型两种蛋白,这两种蛋白从转移至ER内腔开始进入分泌系统。从ER转运至高尔基体,在此浓缩、修饰后被分别转移到细胞表面(分泌型蛋白)或者液泡中。液泡蛋白可能采用两种方式进行转运和贮藏,一是通过致密囊泡(dense vesicles, DVs)将蛋白转运至蛋白贮藏液泡(protein storage vacuole, PSV);二是通过网格蛋白有被小泡(clathrin-coated vesicles, CCV)将蛋白转运至含有裂解酶的酸性液泡中[15]。水稻谷蛋白和醇溶蛋白同在ER表面合成,共翻译至ER内腔,但之后它们分选进入不同的亚细胞区室:醇溶蛋白直接留在ER内腔中,内质网以出芽的方式形成PBⅠ;而谷蛋白前驱体在内质网囊腔中剪切掉信号肤,并接受Bip(lumenal chaperon binding protein)、PDI(protein disulfide isomerase)等分子伴侣的辅助折叠形成正确的构象后,被转运至Golgi体并进一步进行加工修饰,缺省的情况下蛋白将通过网格蛋白有被小泡(CCV)被分泌到细胞膜外,但谷蛋白带有液泡分选信号,则通过致密囊泡,批量运输进入蛋白质储藏液泡(PSV),经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基沉积,形成PBІІ[16]。
本研究的谷蛋白突变体材料Y236,是由宁粳1号经诱变得到的稳定遗传的突变体,通过突变体与Dular配组得到的F2群体进行基因定位,为Y236基因的进一步克隆奠定基础。
1  材料与方法
1.1  植物材料
Y236是一个从宁粳1号经诱变筛选得到的57H突变体。2017年春季在海南与其野生型宁粳1号正反交组合用于遗传分析,同时与已经完成测序的籼稻品种Dular配置杂交组合用于突变基因的图位克隆。水稻植株生长于海南陵水或江苏南京,种植于隔离条件良好的水稻种植条池内。
1.2  实验方法
1.2.1  表型鉴定
在灯箱下观察该突变体的异常表型,取野生型、突变体发育12DAF胚乳,采用2.5%戊二醛(0.1M pH7.0)4度固定12h后,送生命科学实验中心进行后续处理,采用Power Tome XL超薄切片机切片,采用H-7650透射电子显微镜观察。
1.2.2  SDS-PAGE分离种子蛋白
试剂配制:
(1)300:8丙烯酰胺贮存液(30.8%):
甲叉双丙烯酰胺     8g,
丙烯酰胺             300g,
ddH2O溶解后定容至1000mL,滤纸过滤,4℃保存。
(2)1M Tris-HCl缓冲液:
Tris                 121.14g,
ddH2O溶解并用浓盐酸分别调节pH值到6.8或8.8,定容至1000mL,4℃保存。
(3)10% SDS:
SDS                 10g,
ddH2O溶解充分后定容至100mL,室温保存。
(4)10%过硫酸铵(APs):
过硫酸铵             10g,
ddH2O充分溶解后定容至100mL,分装后-20℃冻存。
(5)10×电泳缓冲液:
甘氨酸             144.2g,
Tris                 30.3g,
SDS                10g,
ddH2O充分溶解后定容至1000mL,室温保存。
(6)SDS-PAGE染色液:
异丙醇             250mL,
冰醋酸             100mL,
1g考马斯亮蓝R/G-250,
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