水稻地方品种薄稻中抗稻瘟病基因Pd-bd1候选基因在亲本间的序列差异分析(4)
（4） 吸取上清至1.5 mL离心管里，加入离心管里，加入3/4体积（约600 ul）的异丙醇，上下摇晃，-20度沉淀30分钟。
（5）12000 rpm离心10分钟，倒出液体注意不要沉淀。用1 ml 优尔 ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。
（6）超净工作台吹干或者室温晾（DNA样品不要过于干燥，否则很难溶解）。
（7）加入50-100 ul ddH2O溶解DNA样品，，必要时可于55-60ºC下孵育10 min 助溶。
（8）加RNase A 2 ul消化RNA，37度放置15 min。
（9）放置-70 ℃保存。
1.3 引物设计
引物设计根据NCBI下载的日本晴参考序列，并且使用软件Primer Premier5.0来设计引物。
1.4 PCR反应
采用CTAB精提法提取出的薄稻和苏御糯的基因组DNA为PCR反应模板，10 ul体系如下：
表1-3 10ul PCR反应体系
Table 1-3 10ul PCR system
试剂名称
Reagent Name 用量
Dosage
DNA 0.4 µL
Primer（Foward/Reverse） 0.4 ul/0.4 ul
2*Taq Master Mix(Dye Plus) 5.0 µL
ddH2O 3.8 μL
参考Primer Premier5.0软件中给出的结合温度，设计相应的PCR梯度反应，确定每一对引物的最佳的结合温度（optimal annealing temperature，Ta opt）。1%的琼脂糖胶对PCR产物进行检测，选择条带较亮且非特异性扩增比较少的温度为该引物的最适结合温度。在最适结合温度下利用该引物对苏御糯和薄稻中的目的片段进行扩增并测序