1.2.3 稻瘟病菌的原生质体转化
1.菌株生长15-20d后切适量菌丝于PSB液体培养基中摇培5-7d,145rpm,28℃。
2.5-7d后收集孢子于50mlEP管中。单层滤布(含漏斗)过滤孢子,3500rpm,10min,室温。
3.用新的PSB液体培养基悬浮孢子,并将孢子液吸入新的50mlPSB(含氨苄)中摇培,20-24h,145rpm,28℃(让孢子萌发)。
4.20-24h后配酶解液20ml:Driselase          500mg
                        Lysing enzyme      200mg
                        Chitnase            1mg
补1.2M Kcl至20ml,之后160rpm室温震荡30min,30min后3500rpm,6min,吸上清过细菌过滤器。
5.双层滤布(含漏斗)过滤收集孢子萌发后的菌丝,并用超纯水洗剩余的孢子,弃滤液,将收集的菌丝用注射器针头挑进20ml酶解液中,90rpm,30℃酶解3h。
6.酶解2h后镜检原生质体数量和形态。
7.酶解3h后,用5层擦镜纸(含漏斗)过滤原生质体,3500rpm,4℃,10min。
8.20ml1.2M Kcl漂洗原生质体后3500rpm,4℃,10min。
9.20ml1ⅹSTC悬浮原生质体,3500rpm,4℃,10min。
10.20ml1ⅹSTC第二次悬浮原生质体,3500rpm,4℃,10min。
11.1ⅹSTC第三次悬浮原生质体,根据所需10ml管子的数量选择STC用量,一般一个10ml管子加100-150ul原生质体,敲除载体和CRISPR载体共转,各10ul,之后静置20min。
12.加1ml40%PTC8000,混匀,静置20min。
13.加6mlTB3,(含50ugIml氨苄),过夜28℃摇培36h。
14.36h后覆盖底层,将过夜培养的原生质体加入50mlEP管中,再补bottom TB3培养基50ml,倒5个板,封口,28℃温箱过夜培养。
15.第二天早上覆盖顶层,TOP TB3200ml(含200ugIml潮霉素),即200ml培养基加400ul潮霉素,封口,28℃温箱培养20d左右。
16.挑转化子,粗提转化子基因组,pcr验证敲除情况。
准备工作:
1、配制PSA固体、PSB液体培养基:PSB液体培养基,马铃薯去皮200g,煮沸30min左右至软,20g蔗糖,超纯水定容至1L,PSA固体培养基加15gAgar Powder即可。
2、TB3液体配制:           Yeast Extract               3g
                           Acid hydrolyzed casein      3g
                           蔗糖                        200g
                           补超纯水至1L 121℃ 灭菌20min
3、STC buffer:            蔗糖                        100g
                           0.5M Tris-cl(PH8.0)       50mlor1MTris-cl(PH8.0)25ml
                           补超纯水至500ml 121℃灭菌 20min
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