稻瘟病菌细胞壁完整性通路蛋白参与细胞自噬的功能分析(3)
1.2.3 稻瘟病菌的原生质体转化
1.菌株生长15-20d后切适量菌丝于PSB液体培养基中摇培5-7d，145rpm，28℃。
2.5-7d后收集孢子于50mlEP管中。单层滤布（含漏斗）过滤孢子，3500rpm，10min，室温。
3.用新的PSB液体培养基悬浮孢子，并将孢子液吸入新的50mlPSB（含氨苄）中摇培，20-24h，145rpm，28℃（让孢子萌发）。
4.20-24h后配酶解液20ml:Driselase 500mg
Lysing enzyme 200mg
Chitnase 1mg
补1.2M Kcl至20ml，之后160rpm室温震荡30min，30min后3500rpm，6min，吸上清过细菌过滤器。
5.双层滤布（含漏斗）过滤收集孢子萌发后的菌丝，并用超纯水洗剩余的孢子，弃滤液，将收集的菌丝用注射器针头挑进20ml酶解液中，90rpm，30℃酶解3h。
6.酶解2h后镜检原生质体数量和形态。
7.酶解3h后，用5层擦镜纸（含漏斗）过滤原生质体，3500rpm，4℃，10min。
8.20ml1.2M Kcl漂洗原生质体后3500rpm，4℃，10min。
9.20ml1ⅹSTC悬浮原生质体，3500rpm，4℃，10min。
10.20ml1ⅹSTC第二次悬浮原生质体，3500rpm，4℃，10min。
11.1ⅹSTC第三次悬浮原生质体，根据所需10ml管子的数量选择STC用量，一般一个10ml管子加100-150ul原生质体，敲除载体和CRISPR载体共转，各10ul，之后静置20min。
12.加1ml40%PTC8000，混匀，静置20min。
13.加6mlTB3，（含50ugIml氨苄），过夜28℃摇培36h。
14.36h后覆盖底层，将过夜培养的原生质体加入50mlEP管中，再补bottom TB3培养基50ml，倒5个板，封口，28℃温箱过夜培养。
15.第二天早上覆盖顶层，TOP TB3200ml（含200ugIml潮霉素），即200ml培养基加400ul潮霉素，封口，28℃温箱培养20d左右。
16.挑转化子，粗提转化子基因组，pcr验证敲除情况。
准备工作：
1、配制PSA固体、PSB液体培养基：PSB液体培养基，马铃薯去皮200g，煮沸30min左右至软，20g蔗糖，超纯水定容至1L，PSA固体培养基加15gAgar Powder即可。
2、TB3液体配制： Yeast Extract 3g
Acid hydrolyzed casein 3g
蔗糖 200g
补超纯水至1L 121℃ 灭菌20min
3、STC buffer： 蔗糖 100g
0.5M Tris-cl(PH8.0) 50mlor1MTris-cl(PH8.0)25ml
补超纯水至500ml 121℃灭菌 20min