水稻穗小RNA调控网络的构建与分析(2)
水稻株型的构成因素包括植株高度、分蘖数目、分蘖角度以及穗型等。穗的形成过程是一个涉及腋生分生组织发育、花序结构建成和籽粒发育的复杂生理生化过程，目前已经克隆和研究了很多在各个层面影响水稻穗发育的基因。近年来，一些在水稻穗发育过程中发挥调控作用的重要基因陆续被克隆，它们有的参与调控腋生分生组织的起始，如：LAX PANICLE1（LAX1)基因和LAX PANICLE2 (LAX2)基因[18]、FRIZZY PANICLE (FZP)基因[19]、MONOCULM1(MOC1)基因[20]、SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE14(OsSPL14）基因；有的参与调控穗发育过程中分生组织发育时间的转换，如：RCN1和RCN2基因[21]、ABERRANT PANICLE ORGANIZATION2(AP02)/RFL基因[22]、APO1基因[23]、LARGER PANICLE (LP)基因[24]；有的参与调控枝梗及穗长，如：SHORT PANICL1（SP1）基因[25]、PANICLE PHYTOMER1 (PAP1)基因[26]、DENSE AND ERECT PANICLEIDEP1(DEP1)基因[27]、有的参与调控花序结构内多种分生组织的细胞特性，如ABERRANT SPIKELET AND PANICLE1 (ASP1 )基因[28]。
鉴定miRNA的方法主要有3种：实验克隆、生物信息学以及正向遗传学。在miRNA研究的初期，生物信息学方法发挥了非常重要的作用，而且它主要集中在miRNA和miRNA靶基因的预测两个方面，它是分析miRNA不可或缺的手段。
水稻种子发育、分蘖、光合作用面积和营养物质的运输等都是影响产量的重要因素。水稻株型的构成因素包括植株高度、分蘖数目、分蘖角度以及穗型等。穗的形成过程是一个涉及腋生分生组织发育、花序结构建成和籽粒发育的复杂生理生化过程，目前已经克隆和研究了很多在各个层面影响水稻穗发育的基因。虽然一些关于水稻产量性状的基因已经被鉴定，但是我们对其形成的机制和调控网络了解还有限。本文通过鉴定水稻日本晴穗部的差异表达基因，并通过降解组验证，调节网络构建，深入了解miRNA及其靶基因对水稻穗部生长发育的调控作用，为提高水稻产量和培育新的种质资源提供线索和思路。
1 材料与方法
1.1 高通量测序数据来源
本文所用的所有高通量测序数据均来自NCBI的GEO数据库(Gene Expression Omnibus, http://www.ncbi.nlm.nig.gov/geo)和MPSS数据库(next-Gen Sequence DBs & Web Tools, http://mpss.danforthcenter.org/)检索编号分别为：根，RCn1I、RCn2D[29]；幼苗，SC1I、SC2I、SC3D[30]；茎：ShCn1I，ShCn2D[31]；叶，GSM1081564、GSM1081565[32]；花絮，total_WT、GSM562947[33]、；穗，PC1I、PC1C、PC2C[34]；种子：G1_5，G6_10[35]。水稻降解组高通量测序数据来源于NCBI的GEO数据库，检索编号为：GSM455938、GSM455939、GSM476257[36]、GSE434596[37]。
1.2 高通量测序数据处理
为了能够进行跨数据集的表达量比较，我们对每个数据集中的短序列读数进行了归一化处理，即对于每一个特定的数据集中的一条短序列，起归一化后的读数(normalized count) = [该序列的初始读数(raw count) / 该数据集中的所有短序列初始读数之和 (total counts) ] * 106，归一化后读数的单位为RPM (reads per million)。
1.3 miRNA定量分析
定量分析水稻日本晴穗中的miRNA的表达量，首先我们从miRBase数据库(http://www.miRBase.org)[38]下载了水稻穗中成熟的miRNA和miRNA前体。然后我们利用软件bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net) 把高通量测序数据集中的短序列比对到miRNA前体上[39]。根据成熟的miRNA在前体上的位置和比对结果，利用实验室编写的Python脚本分别进行miRNA、sRNA和phasiRNA的表达鉴定。
1.4 microRNA、sRNA在穗中的差异表达分析
不同组织的高通量测序数据集归一化和miRNA定量表达鉴定后，设置了：20RPM和大于10倍的标准进行了水稻日本晴穗部组织的miRNA的差异表达分析；设置了：100RPM和大于20倍的标准进行了水稻日本晴穗部组织的sRNA的差异表达分析。
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