土荆芥微卫星引物开发+文献综述(2)
，可见修复重金属污染土壤已经迫在眉睫。 超积累植物(Hyperacctunulator)是指一些能够超量累积重金属元素，并且可
以在重金属污染环境下生长良好的植物 00。而随着超积累植物的发现，一种被誉为廉价的重金属污染的“绿色修复技术”[5]即植物修复技术受到了广泛关注。植物修复具有成本低廉,对环境友好,能够有效保持土壤肥力等优点。
藜科植物土荆芥（Chenopodium ambrosioides L.）被提出是一种超积累植物错
误!未找到引用源。。土荆芥是同源四倍体[7]
,目前主要生长在全世界的温带至热带范围。
土荆芥有止痛、祛风、杀虫等作用,可用于医治皮肤风湿痹痛和蛇虫咬伤等症状 [8]
。但目前土荆芥的遗传变异情况尚不清楚，因此急需从分子生物学的角度对该
物种进行遗传学研究，这为本实验的研究提供了方向。 简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)[9]，又被称作微卫星[10]，是指
基因组中以几个核苷酸(多为 2～4 个)为单位重复串联组成的有几十个核苷酸的
重复序列[11]
。SSR分子标记是以 PCR技术为基础的共显性分子标记,它有成本低、
操作简单、稳定性高等特点,所以在基因定位和基因作图等用途上被经常使用 [12]
。同时SSR 分子标记是一个非常重要的分子标记工具，可用于分析亲缘关系、
建立遗传和进化关系树、选择分子标记辅助等方面。SSR 分子标记在植物中已被
大量开发，比如利用大米和拟南芥的全基因组学序列开发出 SSR 标记[13]
。
SSR 引物开发从它的来源来看，主要分为两种，第一种是来源于近缘物种间
的通用性引物；通常认为 SSR 引物在近缘物种间具有一定的通用性。在人与鼠
基因组的对照研究中，找到了 648 个同源标记[14]
。因此普遍认为植物种间扩增
只限于同属或亲缘关系较近的属间通用。第二种则是基于各种方法在本物种间进
行SSR 引物的开发，如富集方法开发、双重抑制 PCR 法、高通量测序法开发等。
磁珠富集法是用探针进行杂交，经过磁珠的富集后获得大量的重复DNA 序列然
后再进行引物开发。 双重抑制PCR法是在简单重复序列的一端加上碱基(1~4个)
作为引物，对两侧具有反向排列的 SSR 序列进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳
检测扩增产物。高通量测序法是运用高通量测序技术对物种进行测序，查找出
SSR 位点，再进行引物开发[15]
。即本实验采用的方法。对于使用近缘物种通用
的引物的方法，虽然简单，方便，但是存在使用范围有限制的情况。原物种的
SSR 基因座在近缘物种间扩增和转移的过程中，存在未知性和盲目性[16]
。在本
物种间进行SSR 标记的开发，可以扩充本物种的标记库的数量,为以后该物种在
分子生物学方向上的进一步研究提供标记基础。
本实验通过重金属污染区和非污染区的实地采样，采集到了云南、湖南等
27 个地区的土荆芥种群。我们通过提取土荆芥种群的 DNA 去开发土荆芥 SSR
引物（微卫星引物），在此基础上，以具有代表性的 18 个土荆芥种群的 322 份
种质资源为实验材料，对其遗传多样性、亲缘关系、分化程度及群体遗传结构等
展开了系统的研究。
1 材料与方法
1.1 样品的采集及处理
2015 年 8 月和 2016 年 8 月，在国内 18 个采样点进行采样，采样点分布如
下：云南 10 个，湖南 4 个，广西 1 个，江苏 1 个，四川 1 个，贵州 1 个。样本
均取自土荆芥健壮无病害的嫩叶，每个采样点收集约 20 个个体，相邻植物之间