土荆芥微卫星引物开发+文献综述(4)
齐。侧翼序列长度大于或等于 50 bp。引物通过 Primers5和Oligo7 软件来设计和
评估。设定主要的参数：GC 含量为 40％〜70％，退火温度为 55℃〜62℃，引物长度为18-28 bp，预期扩增产物的长度为 100-500 bp，无二级结构和二聚体。
1.4 DNA质量的检测
使用 1.0％琼脂糖凝胶和 One Drop * OD-1000 分别检测DNA质量和浓度。将
DNA进一步定量稀释为 100 ng /μl 的溶液，并存储于-20℃。
1.5 SSR-PCR扩增
我们选择了由金唯智有限公司（中国苏州）合成的 100 对引物作为 PCR 扩
增的引物，对稀释后的土荆芥 DNA进行PCR。
PCR 扩增反应体系为： 0.6 μl DNA， 0.6 μl 引物1， 0.6 μl 引物2， 7.5 μl 2
×Taq PCR Master Mix，5.7 μl ddH2O 。
PCR 扩增程序为，95℃ 5分钟，95℃ 30 秒，55℃ 30秒，72℃ 60 秒，35
个循环；72℃ 10分钟。
1.6 SSR-PCR 产物检测
用 2％琼脂糖凝胶电泳对 PCR 扩增产物进行检测，通过凝胶成像系统进行
拍照和分析。然后对扩增出目的条带的引物再用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶
(PAGE)电泳分离特异性条带，并用 0.1％硝酸银对其进行染色。
(1) 用玻璃清洗剂将玻璃板清洗干净，并用去离子超纯水冲洗玻璃板，并晾
干。将玻璃板的平板和短板的灌胶面喷适量的无水乙醇，用无尘纸擦干净，再用
剥离硅烷擦拭，放上垫片，将玻璃板四周对齐，放入灌胶架。
(2) 依次量取25.2 g尿素，12 mL30%聚丙烯酰胺母液，6 mL10×TBE，定
容至60 ml，抽气除去气泡之后加入 0.03 g10%过硫酸铵和50 μl TEMED，混匀
后立即用注射器沿短板的一侧均匀的灌胶，避免产生气泡，灌满后插入梳子并按
紧，至少凝固2 h。
(3) 待胶凝固后，拔出梳子，将胶板安放在电泳槽内，向电泳槽内加入 1×TBE
电泳缓冲液；用移液枪分别吸取 PCR 扩增产物 1 μl ，6 μl 甲酰胺加样缓冲
液10X依次进行点样，150 V电泳5 h。
（4）电泳结束后，撬开玻璃板取出凝胶，用去离子水冲洗两次，再用 0.1%
硝酸银染液浸泡凝胶，放置在脱色摇床上染色 10 min，然后用去离子水冲洗两次，
再用1.2%+0.4%甲醛溶液浸泡凝胶，放置在脱色摇床上至有条带生成再放在水中
显色，然后用扫描仪照相、分析。
1.7荧光毛细管电泳测序
对挑选出的土荆芥 SSR 引物，我们在金唯智（苏州，中国）进行了三种颜
色荧光引物（蓝、绿、黄）的合成，然后进行上述的 PCR 过程。PCR 产物的荧
光毛细管电泳在凌恩有限公司（中国上海）进行.使用ABI 3730自动测序仪在一个泳道中同时运行 3 个标有不同颜色的产物以及 1 个标有橙色荧光的分析量内标。
1.8数据分析
计算出每个群体的数量以及多态性条带所占的百分比。然后，通过
Genemaker软件（版本 3.0）将结果转换为二进制格式，对于每个 DNA样品，在
相同迁移位置上有条带记 1和无条带记0[17][18]
。基于我们以前的研究方法来计算
出以下参数：使用Popgen 32 软件[19][20]
计算等位基因数（NA），Shannon 多样性
指数（I）和遗传多样性指数（h）等指数。使用 Phylip 3.6 软件来进行遗传距离
NJ （neighbor joining）树分析；使用 MVSP 3.2软件分析个体 PcoA （主坐标分析）；
使用 Arlequin 3.11 软件[21]
计算居群间的遗传分化系数（Fst）、AMOVA 并进行显著性检测；使用Structure 2.3.4 软件[22]对18个土荆芥种群开展群体遗传结构分析。