2。2  培养基

LB液体培养液：NaCl 5。00g；蛋白胨 10。00g；酵母粉 5。00g；去离子水 1000mL；pH7。0～7。2。

LB固体培养基：LB液体培养液，琼脂1。5%～2%。

无机盐液体培养液：NaCl 1。00g，K2HPO4  1。50g，KH2PO4  0。50g，NH4NO3 1。00g，MgSO4·7H2O 0。20g，去离子水1000mL。

无机盐固体培养基：无机盐液体培养液，琼脂 1。5%～2%。

2。3  研究方法

2。3。1  金橙II降解酶基因的克隆

通过查阅文献比对分析，将疑似的ORF用PCR 扩增并克隆到pMD-18T载体上，转化到大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)中，进一步验证其金橙II降解活性。

菌株总DNA的制备：论文网

采取高盐法提取菌体总DNA：接种菌株至100mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养。12000g离心1min收集菌体，加等体积的TE（pH8。0）洗涤并重悬菌体于10mL TE中，加溶菌酶至100μg/mL，37℃水浴至体系澄清。加终浓度2%SDS，加蛋白酶K至100μg/mL，37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡15秒。等体积酚：氯仿：异戊醇反复抽提，12000 r/min离心10min，至无白色界面。转移收集上清，加0。6倍体积异丙醇沉淀，毛细管捞出絮状沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于200μL TE（pH8。0）中，保存备用。

疑似基因的PCR扩增：

引物设计：

以已知报道的基因来设计引物，并在引物上分别加入了NdeI和XhoI限制性酶切位点以方便克隆和表达载体的构建。

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PCR反应体系（50μL）：10×PCR buffer（含Mg2+）5μL，dNTP 4μL，引物各1μL，模板DNA 1 μL，Taq酶（5U/μL）1 μL，重蒸水38μL。

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1。5min，30个循环，72℃保持10min。

2。3。2  PCR产物TA克隆验证

将PCR产物与T载体16℃过夜酶连。

酶连体系(10μL)：重蒸水3。5μL，PCR产物4μL，pMD18-T载体1μL，T4连接酶0。5μL，T4连接酶10×Buffer 1μL。

E。coil DH5α菌株感受态细胞制备与转化

从-70℃冰箱中取出用甘油保存的菌株E。coil DH5α于固体LB平板上，37℃过夜培养。待长出菌落后，用接菌环挑取单菌落于100mL液体LB三角瓶中，37℃于摇床上200r/min振荡培养至OD600为0。5左右。4℃条件下，6000r/min，离心5min以获得菌体。用10mL TSB重悬菌体，并于冰上放置10min，分装后于-70℃保存。

取酶连产物10μL，5*KCM溶液10μL，无菌水30μL置于放在冰水浴中的1。5mL离心管中。从-70℃冰箱中取出感受态E。coil DH5α立即融化，取50μL加入上述1。5mL离心管中轻轻吹吸混匀。放置冰水浴中20min后，在室温下再放置10min。加入500μL液体LB，置于摇床上，37℃条件下150r/min振荡培养50min复苏。然后在6000r/min离心2min浓缩菌体涂布氨苄平板筛选。

阳性转化子筛选

质粒DNA的小量提取：将筛选到阳性转化子扩大培养后，取1。5mL菌液，12000r/min 离心1min，用TE重悬洗涤离心1~2次。取菌沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。加200μL新配制的溶液II，室温下放置3~5min。加150μL用冰预冷的溶液III，冰上放置5min。12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，加2倍体积的冰无水乙醇，颠倒混合，于室温下放置5~6min使质粒沉淀。12000r/min离心5min，弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，待所有液体流出后，用1mL 70%乙醇洗涤2次并风干沉淀。待离心管中质粒变透明后，用40μL TER溶解质粒，-4℃待用。