pXZP008载体改造及其应用+文献综述(2)
为研究水稻蛋白OsAGO2和OsPRMT5是否存在互作关系，需要在载体pXZP008上插入pCLEAN-G265的泛素启动子(Ubi-promoter)，对pXZP008载体进行改造；再利用水稻原生质体瞬时转化体系，将水稻OsAGO2、OsPRMT5基因分别连接到表达载体pXZP008-Ubi上，转入水稻原生质体中。其中pXZP008-Ubi质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，有效提高了实验效率[1]。
图1 pXZP008载体结构图
1材料与仪器
1.1实验材料
1.1.1植物
水稻日本晴
1.1.2引物
下划线处为酶切位点
克隆pXZP008多克隆位点基因的特异引物：
pXZP008-Ubi-F CTGCAGTGCAGCGTGACCCGG
pXZP008-Ubi-R CTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG
克隆OsAGO2基因的特异引物：
OsAGO2-pXZP008-Flag-F CCCAAGCTTATGGACTACAAAGACGATGACGACAAAATC
OsAGO2-pXZP008-Flag-R-stop CTAGTCTAGATCAGATGAAGAACATGTTGTCCACCAG
克隆OsPRMT5基因的特异引物：
OsPRMT5- pXZP008-HA-Ubi -F CCCAAGCTTATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACG
OsPRMT5-pXZP008-HA-R-stop TGCTCTAGATTATAGGCCGACCCAATATGATCGACC
1.1.3质粒和菌株
克隆载体pCLEAN-G265，克隆载体pXZP008，大肠杆菌JM109，农杆菌GV3101
（1）主要抗生素：抗生素Ampicillin(20 ug/ml)，Kanamycin(Km，20 ug/ml)。
（2）质粒DNA小量制备试剂盒（离心柱型）购置于杭州爱思进生物技术有限公司，PCR清洁回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购置于AXYGEN公司；引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；限制性内切酶，rTaq酶和T4-DNA连接酶为TaKaRa公司(Dalian, China)生产。
1.1.4培养基
LB培养基（1L）
胰蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g 固体再加入 1.5% 琼脂粉。
1.2主要仪器
PCR仪、小型高速离心机、水平式电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、灭菌锅、恒温摇床、电热恒温水浴锅、低温冰箱、烘箱及微波炉。
2研究方法
2.1 pXZP008载体的改造
2.1.1 pCLEAN-G265的泛素启动子的克隆
以pCLEAN-G265 vector-Primer为模板，以pXZP008 MCS-F, pXZP008 MCS-R为引物，反应体系（共50 ul）如下
（1）高保真PCR扩增PCR反应体系（50μl）如下：
模板DNA 0.5 μl
5×Ps Buffer 10 μl
dNTP 4 μl
Primer Star 0.5 μl
引物F 1 μl
引物R 1 μl
灭菌蒸馏水 Up to 50 μl
反应程序：98℃预变性5min；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸1min/1kb，运行30个循环；72℃ 5 min；4℃反应结束。
（2）琼脂糖电泳检测：PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，120V电泳20-30min，用0.5µg/ml溴化乙锭染色，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。
2.1.2 DNA的回收
琼脂糖凝胶回收DNA采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，具体步骤如下：
(1）在紫外灯下切下目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。称量胶块重量，计算胶块体积，以1mg=1μl计算胶的体积。
(2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
(3）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管，12000×g，离心1min。弃滤液。
(4）将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12000×g，离心30s，弃滤液。