Siva-1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用(2)
细胞凋亡是在多基因联合控制下的细胞程序性死亡过程，受促凋亡基因和抗凋亡基因的共同调节。Siva是近年来发现的促凋亡蛋白家族，其最初是通过酵母双杂交技术克隆得到的一段的cDNA序列， Siva-1是凋亡调节因子Siva编码的选择性剪接体之一。作为促凋亡蛋白家族Siva中的一员，Siva-1可以与多种受体进行结合，进行信号传导，其在攻克目前难以得到有效解决方法的疑难杂症上具有较大的潜力，引起人们的广泛关注，越来越多的学者投入到对Siva-1的研究之中。研究发现Siva-1不仅能够作用于CD27所介导的细胞凋亡，还可作用于多条细胞凋亡通路，如可以参与p53引起的细胞凋亡[2]，抑制Bcl-2/Bcl-xL的抑凋亡功能[3]。在参与其他多种细胞凋亡通路同时，Siva-1还可以抑制NF-kappaB的活性[4]，并且可以通过与非受体酪氨酸激酶c-Abl相互作用来诱导细胞凋亡[5]。在参与抑制Bcl-2/Bcl-xL作用的通路中，Siva-1因为其NH2末端具有一个独特的由20个氨基酸构成的两亲性螺旋区（SAH），通过SAH区域，Siva-1可以结合Bcl-2并消除它们的抗凋亡活性，从而使细胞对UV辐射诱导的细胞敏感而致其凋亡[3] 。SAH介导的细胞凋亡的作用的基础机制是使细胞中线粒体的完整性丧失，引起促凋亡蛋白Bax的活化，该蛋白可以诱导线粒体释放细胞色素c、形成凋亡小体或启动Caspase9和Caspase3最终的活化，最后凋亡执行因子Caspase被活化，通过蛋白水解酶使细胞崩溃，走向凋亡[6] 。
Siva-1是细胞凋亡的主要调节因子，但目前关于其在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用还未见报道。本研究拟通过敲减猪卵巢颗粒细胞中的Siva-1基因，研究Siva-1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，及其作用机制，以期为解析猪卵泡闭锁机制提供参考。
1 材料与方法
1．1 引物设计与合成
根据GenBank中收录的相应基因（Siva-1、Bcl-2和GAPDH）的mRNA序列，应用Primer 5.0软件设计引物，用于基因定量分析。引物序列信息和扩增条件见表1。
1．2 干扰RNA的合成
用于敲减猪Siva-1的siRNA由上海吉玛生物公司合成。Siva-1-siRNA序列为：5′-GAU CAU GCA GCU CCU CUU UTT -3′，5′-AAA GAG GAG CUG CAU GAU CTT-3′。NC-siRNA编号为4611。利用脂质体2000将Siva-1-siRNA和NC-siRNA分别转染体外培养的猪卵泡颗粒细胞中，具体方法见操作说明书。
1．3 转染
1．3．1 转染24h前，胰酶消化细胞，进行细胞铺板操作。细胞铺板在含有2ml血清、培养基中（培养基中不含抗生素），使其在进行转染前能够达到90%-95%的融合度。
1．3．2 对于培养基中每孔所含有的细胞，均使用2ml无血清培养基对4.0µg质粒进行稀释，充分混匀。使用前取Lipofecatamine2000转染试剂，轻轻混匀。每孔细胞用250µl无血清培养基稀释10µl Lipofectamine2000转染试剂。轻轻混匀后在室温条件下孵育5min。将孵育好的Lipofectamine2000转染试剂同稀释好的质粒混合，因为长时间孵育会影响转染活性，所以混合时间要控制在30min以内。稀释的Lipofectamine2000和混合稀释的质粒体积总的为500µL。轻轻混匀，在室温条件下放置20min，使得DNA- Lipofectamine2000复合物形成。