平沙绿僵菌NJMP2103对东亚飞蝗的室内毒力测定(3)
1.2 供试蝗虫
供试的东亚飞蝗为中国农业科学院植物保护研究所提供的实验室内世代连续饲养的无病群体。饲养条件为28℃，光周期为16L:8D，以实验室温室独立种植的小麦苗作为食物。试验选取4龄东亚飞蝗蝗蝻进行毒力测定。
1.3 生物测定方法
试验分别采用喷雾法与显微注射法，测定平沙绿僵菌NJMp2103对东亚飞蝗的毒力。
（1）喷雾法
前先将菌株接种到灭菌后的PDA固体培养基中，在25℃的恒温环境下连续培养10天得到分生孢子，用灭菌的铁勺将PDA固体培养基表面全部的孢子刮到50ml的离心管中，加入0.05%的Tween-80灭菌水溶液和5-6颗无菌玻璃珠，之后放在涡旋振荡器中做涡旋处理10分钟使孢子完全分散，涡旋震荡后用灭菌的擦镜纸过滤去掉其中的菌丝，用血球计数板统计每毫升的孢子数量，换算成孢子悬液浓度后稀释配成1×108孢子/ml浓度的孢子悬浮液。将12只蝗虫作为一组，均匀的放入烧杯中，然后用手持式孢子喷雾器在烧杯中对蝗虫进行均匀喷雾处理，每组喷洒的量为0.35ml。处理后将东亚飞蝗转入养殖筐中放入恒温箱以28℃，光周期16L:8D的条件下饲养。
（2）显微注射法
测试前先将菌株接种到灭菌后的PDA液体培养基中，密封后置于摇床中25℃、200r/min培养5天，使用灭菌后的擦镜纸过滤菌丝后获得芽生孢子悬浮液，之后用同样的方法配成1×107孢子/ml浓度的孢子悬浮液。取0.5μL注入供试东亚飞蝗的第三第四腹节之间，15只试虫为一组，转入养殖筐中放入恒温箱以28℃，光周期16L:8D的条件下饲养。
以上试验在进行过程中，每天观察记录1次试虫的感病症状和死亡虫数，并及时将出现的死虫转移出来，每处理重复3次，以含0.05% Tween-80的灭菌水处理三个重复的蝗虫作为对照。
1.4 菌株鉴定
为了进一步确定是否是平沙绿僵菌NJMp2103起到了杀死东亚飞蝗的效果，对从供试东亚飞蝗尸体上取得的真菌进行了鉴定。首先挑取少量菌体，在25℃的恒温环境下置入容量为100mL的锥形瓶中做摇菌处理，转速为200r/min，无菌连续培养5d。采用CTAB法提取真菌基因组DNA，取少量菌丝团，过滤并用吸水纸压干后放入灭过菌的匀浆器中，液氮研磨（加CTAB研磨）。将菌丝粉末置于2mL离心管中，加入2% CTAB提取液700—800μL，80μL 10%SDS，涡旋混匀，于60℃水浴锅中水浴30min，期间每隔10min上下颠倒一次，混匀。加入等体积CIA氯仿/异戊醇（24:1），摇床上200r/min，20min。然后，于13000rpm，离心5min，吸取上清液（DNA在上清中，约700μL)置于干净的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。13000rpm，离心5min，吸取上清液（约700μL）置于干净的1.5mL离心管中，加等体积CIA，混匀。13000rpm，离心5min，吸取上清液（约700μL）置于干净的1.5mL离心管中，加2倍体积无水乙醇，于-20℃静置30min以上，沉淀DNA。13000rpm，离心5min，移除上清，将沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；加100μL灭菌水（ddH2O）溶解沉淀，加入1-2μL RNase（20μg/mL），37℃消解大于20min后，-20℃保存备用[6]。以提取对DNA为模板，使用ITS4-ITS5引物进行PCR扩增，电泳检测，并将获得的目的条带回收，送于南京金斯瑞公司测序。测序结果通过在NCBI数据库中进行Blast序列对比进行鉴定[9]。
1．5 数据分析
根据所得的数据计算东亚飞蝗的校正死亡率（公式1-1），校正死亡率又称更正死亡率，通过空白对照组的自然死亡率加以校正的药剂处理组的死亡率，以消除自然因素对药效的影响。
校正死亡率＝（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）