茶树γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆及其组织逆境表达差异的研究(3)
1 材料与方法
1.1植物实验材料
本试验的供试材料为南京农业大学研究所种植的黄金芽（C. Sinensis cv. huangjinya）、安吉白茶（C. sinensis cv. Anjibaicha）、迎霜（C. sinensis cv. Yingshuang）二年生、自然条件下生长的扦插幼苗。用一正常的黄金芽品种茶树幼叶进行DNA提取，并使之作为GGT1和GGT3基因克隆模版。分别对黄金芽、安吉白茶、迎霜 3 个茶树品种的正常植株进行低温（4℃）和高温（38℃）逆境胁迫处理,并用在自然状态下（室温 20℃）未处理的二年生扦插植株为对照，采集处理 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h 的茶树叶片，提取叶片样品的 RNA 并反转录成 cDNA，用于实时荧光定量 PCR。
1.2总RNA提取
总RNA的提取采用Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒提取。实验过程中使用的全部塑料制品均经0.1% DEPC水浸泡过夜，灭菌后烘干密闭保存，玻璃制品于烘箱内180 °C干热灭菌3 h。操作步骤如下：
(1)准确称取0.1 g叶片组织，将叶片在液氮中磨碎。加入1 mL细胞裂解液，待研钵中液体澄清后转入1.5 mL离心管中。
(2)将离心管中加入300µL去蛋白液和200µL自备氯仿在振荡器上振荡30s混匀。
(3)4 °C，12000 rpm离心5-10 min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
(4)加入等体积漂洗液，充分颠倒混匀。然后将混合液转入离心吸附柱中，12000 rpm 室温离心1 min。
(5)加入500µL洗柱液，12000 rpm 室温离心1 min。再加入500µL洗柱液，重复一遍，12000 rpm离心1 min。
(6)膜上消化DNA，重复一遍。
(7)在离心吸附柱中加500µL去酶液，盖上盖后颠倒数次，12000 rpm 室温离心1 min。
(8)室温空离12000 rpm 2min。
(9)将吸附柱转入新的离心管中，加入50-100µL洗脱液，室温放置3-5 min，4 °C，12000 rpm离心1min。弃吸附柱，将所得RNA保存于-80 °C。
1.3总RNA的纯化及检测
(1) 纯化体系
总RNA (μg/μL) 20-50 μg (42.5 μL)
10×DNase buffer 5 μL
DnaseI (5 U/μL) 2 μL
RNase 抑制剂 (40 U/μL) 0.5 μL
DEPC-H2O Up to 50 μL
(2)37 °C温浴30 min，降解DNA，然后70 °C反应10 min以灭活DNase。
(3)转入500 μL离心管中加入50 μL DEPC-H2O，再加入100 μL（与混合液等量）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀，4 °C，12000 rpm离心10 min。
(4)取上清，移入另一微量离心管中，加入100 μL（与上清等量）氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀，4 °C，12000 rpm离心10 min 。
(5)取上清，加入 10 μL（1/10 体积）3 M NaAc（pH=5.3）和250 μL（2.5倍体积）预冷的异丙醇（无水乙醇），-20 °C沉淀1-2 h 。
(6)4 °C，12000 rpm离心20 min，弃上清，用预冷的75% 乙醇洗RNA沉淀2~3 次，于超净工作台中晾干5~10 min，沉淀溶解于30 μL DEPC-H2O中。
(7)取3 μL产物用Agarose凝胶电泳检测，电泳电压为120 V，20 min后观察并拍照。
(8)用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和OD值，根据OD260/OD280和OD260 /OD230的比值判断RNA的质量。
1.4cDNA合成
采用了TaKaRa公司的M-MLV反转录酶及特殊引物AP：GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17进行实验。
具体操作过程如下：
向灭菌的200 μL离心管中加入下列试剂：
模板RNA 1 ng~1 μg
AP (10 μM) 1 μL
RNase free ddH2O up to 15 μL
70 °C保温5 min后迅速置于冰上急冷5 min。
离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。
在管中继续加入如下反转录反应液：
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