茶树γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆及其组织逆境表达差异的研究(4)
模板RNA/引物变性溶液 15 μL
dNTP Mixture (l0 mM ) 1.25 μL
5×M-MLV Buffer 5 μL
RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL
RTase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL) 1 μL
RNase free ddH2O up to 40 μL
42 °C保温1 h，70 °C保温15 min后于冰上冷却，所得cDNA溶液于-20 °C保存备用。
1.5茶树CsGGT1和CsGGT3基因的克隆。
根据本课题转录组数据设计克隆引物，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
PCR（Polymerase Chain Reaction）
PCR体系
10×Ex Taq Buffer ( Mg2+ free ) 2 µL
2.5 mM dNTP 1.6 µL
25 mM Mgcl2 1.2 µL
Primer-F 1 µL
Primer-R 1 µL
cDNA 1 µL
Ex Taq 0.3 µL
ddH2O 11.9 µL
Total 20 µL
CR程序
95 °C 5 min
94 °C 30 s
T °C 30 s 35 Cycles
72 °C 1 min
72 °C 7 min
4 °C ∞ 注：T为由引物决定的退火温度。
反应后体系进行Agarose凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察并拍照，并与紫外灯下将目的条带切下，按照Gel Extraction Kit(OMEGA)使用说明书回收目的条带。回收产物经Agarose凝胶电泳检测质量后，于-20 °C下保存。
上一篇：蒿属植物及其近缘种挥发性成分分析