华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查研究(2)
PCV2基因组含1766～1768个核苷酸，病毒粒子为二十面体对称结构，直径约17nm，无囊膜，不具有血凝活性[5]。PCV2基因组包含三个主要的开放阅读框，分别为ORF1、ORF2和ORF3[11]。ORF1位于病毒基因组链上第51-995nt，编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep’；ORF2位于病毒基因组的互补链上第1735-1034或1734-1033或1735-1030nt，编码与病毒抗原性和毒力相关的衣壳（Cap）蛋白[12]；ORF3位于病毒基因组的互补链上第671-357nt，编码病毒致病性相关蛋白，通过诱导细胞凋亡在病毒的发病机制中起重要作用[13-14]。PCV2基因组序列之间的差异主要是在于其ORF2的变异，而ORF1高度保守。 PCV2 ORF2的大多数基因是表现出高度多态性的抗原表位的区域[15]。
研究表明，基于基因组序列的系统发育分析，PCV2可以分为五种基因型（亚型）：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e［16]。三种主要的基因型（PCV2a，PCV2b和PCV2d）在全球普遍存在[17-19]。自1999年以来，PCV2在中国猪场首次报道后，PCV2a，PCV2b，PCV2d，甚至PCV2e均已在中国不同地区被鉴定[20]。近年来，在猪场中鉴定出具有重要遗传变异和基因型的变化。2003年以前，中国和欧洲发现PCV2a和PCV2b两种基因型，而美国和加拿大仅存在PCV2a这一种基因型，且当时PCV2a是最流行的基因型。2004年以来，几乎所有的分离株都是PCV2b型，PCV2a型越来越少，PCV2b成为最广泛和最主要的基因型[21]。自2009年以来我国PCV2d明显增多，Li等[21]对2004-2014年间采集自我国河北地区的组织样品进行病原学检测，对其中12株进行全基因组测序分析，结果显示PCV2b有7株，PCV2d有5株，PCV2d的比例明显增加。
研究结果显示，2009年以前，PCV2分离株主要属于PCV2b基因型，自2009年以后转为PCV2d[22]。目前，我国PCV2分离株的基因型有由PCV2b向PCV2d变化的趋势[21]。
本研究对2015-2016年采集自我国华东地区的发病猪肺脏、淋巴结样品进行检测，对检测为阳性的样品进行全基因序列扩增，基于完整基因组序列的系统发育分析，确定了2010-2016年我国华东地区猪场发生的PCV2遗传变异，并阐明该区域PCV2分离株的基因型和流行现状，为我国猪圆环病毒病的预防与控制提供依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源
本研究所采取病料为2015年1月至2016年12月期间临床发病猪场猪的肺、肾、脾、肝以及腹股沟淋巴结，共298份，分别来自华东地区江苏、安徽、浙江等省份。
1.1.2 主要试剂
Platinum® Taq DNA Polymerase、10×HiFi Buffer(Mg2+ Free)、dNTP Mix、50mM MgCl2、2×PCR Taq Plus MasterMix、DL2000TM、pMD19-T Vector、Hind III、EcoR I内切酶、质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒均购自大连宝生生物工程（TaKaRa）有限公司；质粒抽提试剂盒购自上海生工公司产品；其余胰蛋白胨、琼脂粉、乙醇、氨苄青霉素等试剂和仪器由本实验室提供。
1.1.3 主要仪器
PCR仪（大连 TaKaRa TP600），冷冻台式离心机（德国eppendorf centrifuge 5417R），微量移液器（德国eppendorf），数码凝胶图像处理系统（上海Tanon 4500），其他常规仪器和设备都由本实验室提供。
1.2方法
1.2.1样品采集和处理
从猪场采集发病猪群病料，包括血液和内脏组织（肺、脾、肝、肾以及腹股沟淋巴结）。将组织病料剪碎后用玻璃匀浆器研磨，制成匀浆，于-80℃反复冻融3次，4℃、6000r•min－1离心10min，取上清备用。
1.2.2病料DNA的提取
在1.5ml离心管中加入100ul处理好的样本液，然后加入300μL核酸提取液，振荡混匀，室温静置2-3min；加入400μL异丙醇，振荡混匀，12000rpm离心5min，弃净溶液；加入600ul 50%异丙醇，振荡混匀，12000rpm离心1min，弃净溶液；加入600ul 75%乙醇，振荡混匀，12000rpm离心1min，弃净溶液；离心管短暂离心10s后，用10μL枪头弃净溶液，开盖室温干燥3min；加入30μL洗脱液，振荡混匀后短暂离心，置于-20℃保存。