华东地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查研究(4)
取DH5α甘油菌10μL至LB液体培养基中，37℃摇床培养16h；第二日取新鲜大肠杆菌DH5α 200μL至LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD值0.6；取出冰浴5min；吸1.5mL至EP管，4℃，3800rpm，离心5min；弃上清，使残液流尽，加冰预冷的0.1M CaCl2 500μL重悬菌体，用枪头轻吹混匀；冰浴30min，4℃，3800rpm，离心5min；弃上清，留沉淀，置冰中，加预冷200ulCaCl2重悬菌体，轻吹混匀，置4℃，2h后可用。
1.2.8 PCV2全长序列的克隆与鉴定
将10μL连接产物加至制备的DH5α感受态菌，轻轻混匀，水浴30min；42℃热休克90s，冰浴5min；在超净台内加800μL LB液体培养基混匀，37℃摇床培养2h；4℃，5200rpm，离心5min，弃800μL上清，留200μL上清来重悬菌体，用三角玻棒均匀涂布于氨苄平板培养基，37℃恒温箱培养。
在37℃培养12～16h后，挑取白色单菌落接种于1mL含Amp的液体LB培养基中，37℃振荡培养3h，然后做菌落PCR鉴定。PCR扩增反应体系为25μL，反应成分如下：上下游引物P1/P2各1μL、dNTP 2 μL、10×Buffer 2.5μL、菌液 2.5μL、LA Taq酶0.5μL(5U/μL)，用灭菌双蒸水补齐使总体积达到25μL。PCR循环条件为：94℃ 5 min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，30循环，72℃ 10 min，16℃保存。菌落PCR阳性的菌将菌液接种5 mL含Amp的液体LB培养基培养过夜后，参照TaKaRa质粒DNA提取试剂盒说明书提取质粒。将质粒用限制性内切酶EcoR I和HindⅢ进行阳性重组子的双酶切鉴定，体系为20μL：10× Buffer 2μL，EcoR I 1μL，HandIII 1μL，质粒1μL，ddH2O 15μL,37℃水浴3h 。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现大小约1767bp或1768bp条带的质粒为阳性。
1.2.9序列测定与分析
将菌落PCR为阳性的菌液，一份保存于15%灭菌甘油里，另外一份送去测序。测序结果和GenBank中选取的参考毒株序列用DNAStar软件进行分析，比较各PCV2分离株和已发表的PCV2全长基因序列的同源性，并将序列上传于GenBank，获取基因号。将本实验分离得到的12株序列与本实验室2010-2012年分离的37株序列，GenBank上下载的13株2013-2014年间我国华东地区的序列（表1-2）以及25株世界各国和地区已经确定亚型的参考毒株全基因序列（表1-3），使用Mega5.0软件通过邻并法（Neighbor-Joining，NJ）进行遗传进化分析，同时将这些毒株的ORF2基因序列进行遗传进化分析，并生成系统进化树。