1.2.3  引物设计与合成
    用于扩增圆环病毒2型全基因组序列的引物引用自LiLimin等[21],同时根据M. Vlasakova等[23]设计了3对重叠的引物来获1767bp全长片段。本研究 PCV2M1/M2(460bp)鉴定引物,扩增PCV2 ORF2基因的引物为本实验室设计和保存,见表1-1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1-1  PCV检测引物和扩增全序列引物
Table 1-1  Primer sequences designed for detecting PCV2 and amplifying PCV2 whole genome
反应类型/引物序列
Type of reaction/ Primer sequence(5′→3′)    退火温度/℃    产物长度/bp
    Annealing temperature    Product length
扩增PCV2 ORF2基因
PCV2M1 5’- AGAAGGGCTGGGTTATG-3’    50.3    460
PCV2M2 5’-TATCCAAGGAGGCGTTAC-3’    50.7   
扩增PCV2 全长基因       
PCV2-F 5’- GCTGGCTGAACTTTTGAAAGT -3’    48    1767
PCV2-R 5’-AAATTTCTGACAAACGTTACA -3’       
PC1 5’-GAGAAAGCGAAAGGAACAG-3’     55    1140
PC2R 5’-GAAAGGTTAAGGTTGAATTCTG-3       
PC3 5’-GTTGGAAGTAATCAATAGTGG-3’    55    976
PC4R 5’-CAGCAGTAGACAGGTCAC-3’       
PC5 5’-TGTTCACTCTGAATAATCCTTC-3’    55    638
PC6R 5’-ACACAGTCTCAGTAGATCATC-3’       
1.2.4样品中PCV2的检测
将上述提取的样品DNA模板进行PCV2的ORF2基因扩增。PCV2检测用的上下游引物PCV2M1/M2(10μmol•L-1)各1μL,Mix 12.5μL,加入2.5μL提取的病毒核酸,加入灭菌双蒸水至25μL,PCR循环条件为:94℃ 5min;94℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 1min,30循环,72℃ 10min,16℃保存。当PCR结束后在1%的琼脂糖胶上进行电泳,在紫外灯下成像。若条带大小为460bp,则为PCV2阳性。将阳性DNA样品放-20℃保存备用。 
1.2.5 阳性样品PCV2全序列的扩增与PCR产物回收
    在鉴定为PCV2阳性的部分样品中,选取条带较亮样品的DNA作为模板,用全长引物或重叠引物进行全序列的扩增。PCR扩增反应体系为50μL,反应成分如下:上下游引物P1/P2各2μL、10×dNTP 1μL、10×HiFi Buffer 5μL、50mμMgSO4 3μL、DNA模板 3μL、Platinum Taq HiFi酶0.5μL(5 U/μL),用灭菌双蒸水补齐使总体积达到50μL。PCR进行程序:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,68℃延伸2min,共进行32个循环;然后68℃延伸5min,置4℃保存。PCR结束后在1%的琼脂糖胶上进行电泳,参照TaKaRa PCR产物纯化试剂盒说明,将阳性扩增条带进行纯化。将PCR产物加入5倍体积的Buffer CP,涡旋混合均匀,瞬时离心,将溶液收集到底部。转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中,室温下,10000g离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回到收集管中。加入700μL DNA Wash Buffer至吸附柱中,室温下,1000g离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回到收集管中,并重复该步骤一次。室温下,10000g,将吸附柱开盖离心2min,去除残留的乙醇。转移吸附柱至1.5ml收集管中,加入45μL 60℃ 预热的Elution Buffer至吸附柱膜中央,室温放置2min,13000g离心1min,得到PCR回收产物。
1.2.6 目的基因连接
将回收产物与pMD19-T载体连接,连接反应体系为:回收的PCR产物4.5μL,Solution I 5μL,pMD19-T载体0.5μL,总共10μL,16℃连接过夜。
1.2.7  感受态制备
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