利用酵母双杂交技术筛选NLR1-V的互作蛋白(2)
植物抗病基因中NBS-LRR是一大类抗病基因，根据抗病基因序列特点和结构主要分为五大类[6]：NBS-LRR (nucleotide binding site plus leucine rich repeat) 类 、LRR-TM (leucine-rich repeat plus transmembrane receptor)类、STK (serine-threonine kinase)类、RLK (recepetor like kinase)类和 SA-CC (signal anchor plus coiled-coil)类，其中NBS-LRR类抗病基因又可分为两种亚类为TNL（Tir-NBS-LRR）和CNL(non-Tir-NBS-LRR or CC-NBS-LRR)两个亚家族，目前发现的大多数单子叶植物的NLR基因都属于CNL类，且前人研究证实了单子叶植物中尚未发现CNL类基因[7-9]。本研究所研究的基因NLR1-V即为CNL类抗白粉病病基因，该类抗病基因编码蛋白主要含有三个结构域Tir(Toll-interleukin-1 receptor domain)、CC(coiled-coil)结构域、NBS(nucleotide-binding site)结构域以及LRR(leucine-rich repeat)结构域。CC 结构是许多蛋白的功能域，包括结构蛋白、驱动蛋白和转录因子，已有研究证明该结构域在蛋白质间的相互作用中起重要作用[1, 3, 10]；NBS结构域，核酸结合位点，因为该结构域比较保守，同样也是三个结域中最保守的部分，也常常被广泛地用作植物抗病基因识别和分类的标志，约 300 个氨基酸；LRR即为富亮氨酸重复，该结构域和其他两个结构域相比保守性较低，但也有研究发现LRR具有识别病原菌的作用[11]，通过酵母双杂交技术证实了LRR结构参与了蛋白之间的识别[12, 13]。
本实验室前期利用分子标记将Pm21定位到6VS的FL:0.45-FL:0.58区段[14]，并将细胞遗传学与分子遗传学的方法相结合，克隆得到Pm21基因座的关键候选基因S/tpk-V[15]目前实验室根据新鉴定出的6VS小片段易位材料加密该区间的分子标记，缩短了Pm21所在区间，并对目标区段中的NLR类基因进行挖掘，在抗病材料T6VS6AL和其感病突变体中克隆得到基因NLR1-V，对该基因进行序列比对分析，同时构建载体对其功能进行分析。那么，该基因蛋白在小麦抗白粉病的抗病通路中与哪些基因蛋白相互作用以及如何通过互作发挥抗病机制的呢？所以，本研究对NLR1-V基因蛋白在小麦抗病通路中与哪些蛋白有互作进行初步筛选，获得候选基因，为之后探索该基因介导的抗病机制提供依据。
目前存在很多种研究蛋白质互作的方法，为蛋白研究领域提供了很多平台，有：融合蛋白 pull-down 实验、亲和印迹、免疫共沉淀、蛋白探针筛选、噬菌体展示、荧光共振能量转移、酵母双杂技术、双分子荧光互补技术等[16]，以上技术均有巧妙的原理。例如融合蛋白 pull-down 实验，该技术将目的蛋白与种标签蛋白以融合蛋白的形式表达，然后将融合蛋白在不同标签蛋白的色谱柱上纯化，最后得到诱饵蛋白，因此诱饵蛋白也被固定在含有相应基质的色谱柱上，将细胞抽提物通过色谱柱后，如果蛋白能够与诱饵蛋白发生相互作用，那么发生作用的蛋白很可能被吸附保留下来，没有发生作用的蛋白就会洗脱液洗脱掉，由此得到了与目的蛋白互作的蛋白；亲和印记又可称为western印记检测，类似于DNA的southern杂交，将聚丙烯酰胺凝胶上分离好的样品转移到硝酸纤文膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影，但该技术的缺点是实验在细胞外进行，可靠性不高；荧光共振能量转移技术则是将两种目的蛋白分别与两种可以转移能量的蛋白融合表达，在一种荧光的激发下看是否可以激发另一种荧光则可以初步鉴定这两种蛋白是否可以互相作用。
由此看来筛选互作蛋白的方法多种多样但最常用方法还是酵母双杂交技术，该技术是一种在细胞内直接检测蛋白质间互作的方法，其基本原理是基于对酵母的转录因子GAL4 具有两个独立的结构域DNA 结合结构域 (DNA binding domain,简称BD) 和转录激活结构域 (activation domain, 简称AD)的研究。顾名思义，DNA结合结构域BD结构域负责特异的结合激活序列，而转录激活结构域AD可以启动下游靶基因的转录，这两个结构域各自具有独立的功能，可以单独存在，但当它们分别与激活序列结合时并不能激活转录功能，只有通过化学键将二者建立起空间结构才会激活基因的转录[17]。利用基因工程技术将钓饵基因构建于含有 BD 融合蛋白的表达载体，将文库分别构建于 AD 融合蛋白的表达载体，将二者依次转入同一酵母细胞内表达，如果两个蛋白之间有相互作用，必然会使 BD 和 AD 结构域在空间上靠近发生作用从而形成具有完整活性的转录因子并激活报告基因的转录，通过报告基因的表达与否来反映两个蛋白质之间有无相互作用，在初步确定有互相作用后对阳性候选克隆进行复筛以及后续验证实验[18-20]。
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