酵母组蛋白提取方法的优化与探索(7)
计算机Image J 图像曝光软件 配制酵母培养基YPD
调整PH值
使酵母培养基YPD高压灭菌
培养繁殖酵母菌
沉淀酵母细胞（全蛋白）
沉淀酵母细胞（组蛋白）
使酵母细胞与缓冲溶液混合充分
酵母组蛋白吸光度
加速破裂组织细胞壁
煮蛋白
分离蛋白
将胶上的蛋白条带转移到膜上
膜染色过夜
曝光蛋白条带
3.2 实验化学试剂
在实验过程中所用化学试剂与药品列表表示如下：
表3.2 实验所用化学试剂与药品
化学试剂与药品 级别 生产厂家
三氟乙酸TCA
异丙醇
甲醇
乙酸
丙酮
硫酸
蒸馏水
30%丙烯酰胺
10%十二烷基硫酸钠溶液SDS
10%过硫酸钠溶液 APS
四甲基二乙胺 TEMED
甘氨酸
溴酚蓝
甘油
1%磷酸盐缓冲溶液PBS
牛血清蛋白BSA
上样缓冲液
转膜缓冲液
考马斯亮蓝染色液
丽春红染色液
细胞裂解酶
一抗（H3-HRP）
一抗（兔抗 anti-rabbit）
二抗（3-OH）
曝光液A\B
酵母培养基YPD配方：
（1）细菌蛋白胨Bacto-peptone
（2）葡萄糖
（3）酵母油提物Yeast extract
（4）色氨酸
分离胶配方：
（1）蒸馏水
（2）30%丙烯酰胺
（3）1.5mol Tris-Hcl PH 8.8
(4) 10%十二烷基硫酸钠溶液SDS
（5）10%过硫酸钠溶液 APS
（6）四甲基二乙胺 TEMED
浓缩胶配方：
（1）蒸馏水
（2）30%丙烯酰胺
（3）1.0mol Tris-Hcl PH 6.8
(4) 10%过硫酸钠溶液 APS
（5）10%过硫酸钠溶液 APS
（6）四甲基二乙胺 TEMED
固定液配方：
（1）50%乙醇溶液
（2）10%乙酸溶液
（3）40%蒸馏水
染色液：
（1）1.6%H3PO4
（2）8%（NH4）2PO4
(3) 0.12% CBBG 250
(4) 20%甲醇溶液
缓冲溶液A1（用于提取全蛋白中）
（1）氢氧化钠
（2）β-巯基乙醇
2X SDS Loading buffer
(1) Tris-Cl PH 6.8
(2) 4%SDS 溶液
(3) 0.2%溴酚蓝指示剂
（4）20%甘油
（5）200mM DTT试剂
SP缓冲溶液
（1）4-羟乙基哌嗪乙磺酸; N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸 HEPES
（2）山梨醇
（3）二硫苏糖醇 DTT
NIB缓冲溶液
（1）蔗糖（固体）
（2）氯化钾（固体）
（3）氯化镁（固体）
（4）氯化钙（固体）
（5）4-吗啉乙磺酸 MES
（6）苯甲基磺酰氟 PMSF
（7）聚乙二醇辛基苯基醚 Triton X100
缓冲溶液A2（用于提取组蛋白中）：
（1）Tris-Hcl 缓冲液
（2）NP 40 裂解液
（3）氯化钠
（4）丁酸钠
（5）苯甲基磺酰氟 PMSF
缓冲溶液B：
（1）Tris-Hcl 缓冲液
（2）氯化钠
（3）丁酸钠
（4）苯甲基磺酰氟 PMSF 分析纯（AR）
3.4 实验材料
酵母细胞wild-type样品由清华大学生物实验室提供,供中国科学院上海药物研究所化学与蛋白质组学实验室进行分析实验。
3.5 提取分离
（一）培养酵母细胞
① 分别在电子天平上称量细菌蛋白胨Bacto-peptone 28g、葡萄糖20g、酵母油提物10g、色氨酸0.15g ，即配制酵母培养基YPD于1L烧杯中，并分装在四个500ml锥形瓶中，每瓶约250ml。充分混匀。
② 将四个锥形瓶封闭放置于高压灭菌器中，高压蒸汽灭菌约1小时。
③ 灭菌完毕，取出锥形瓶并冷却至室温。同时取出冻存于4℃冰箱中的酵母细胞wild-type样品。