LamB基因的克隆及其在肺炎克雷菌中的表达(2)
碳青霉烯类抗生素属于β-内酰胺类抗生素，它是在把青霉素结构进行了改造后形成的[5]。现如今，国内有的这类抗生素包括美罗培南、亚胺培南、比阿培南和厄他培南等等。这类抗生素主要是通过抑制粘肽转肽酶催化的转肽反应，来间接阻止细胞壁粘肽的生成，进而导致细菌细胞壁受损，菌体发生肿胀使得细菌胞浆渗透压发生了改变，细胞发生了溶解，从而杀灭细菌[6]。由于哺乳动物本身没有细胞壁因此不会受这类药物的影响，所以此类药物具有选择杀菌作用。此类抗生素在杀菌过程中只诱导细菌产生最低浓度的内毒素，这与其他同类抗生素不同，因而更适合用来治疗由细菌引起的感染。
膜孔蛋白是指细胞膜上的孔蛋白，属于外膜蛋白一类，包括特异性和非特异性两类，前者只能让特定的物质通过，与细菌的耐药性没有关系，而后者则能让多种分子通过例如抗生素，与细菌的耐药性有关系[7]。ompK35、ompK36和ompK37都是肺炎克雷伯氏菌产生的膜孔蛋白，这些膜孔蛋白与它的耐药性有关，但其中ompK37基本上不表达[8]。细菌膜孔蛋白的缺失或者数量上的减少都会使其外膜的通透性降低，这就使其导入的相应药物不能进入到细菌体内，也就起不到杀菌作用，细菌就产生了耐药性[9]。膜孔蛋白ompK35和ompK36对抗生素进入细胞的过程有着重要的作用，如果它们出现缺失或者数量上减少细菌对碳青霉烯类药物的通透性就会降低。而膜孔蛋白ompK37虽然基本上不表达但它对抗生素进入细胞的过程同样也有影响，如果它表达量提高，碳青霉烯类药物有杀菌作用，反之它表达量降低，菌体就会对药物产生耐药性[10]。
1.材料与方法
1.1供试材料
1.1.1菌株：肺炎克雷伯氏菌菌株KPM1176（该菌是KPM1027的ompK36发生移码突变的突变体）、KPM2444（该菌是从KPM1176中筛选出来的美罗培南抗性突变株）。
1.1.2常用试剂和培养基的配制
1) LB培养基：称量Tryptone 10g,Yeast Extract 5g,Nacl 10g,置于1L的烧杯中，向烧杯中加入去离子水约800ml充分搅拌使溶质溶解，再加入5N 氢氧化钠,使pH值达到7.0，加无菌水将培养基定容到1L,高温高压灭菌后4℃保存。
2) MHB培养基：
3) 溴化乙锭（10mg/ml）
4) 50×TAE电泳缓冲液：称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g置于1L的烧杯中，并添加无菌水约800ml，用玻璃棒搅拌使其完全溶解，之后加入57.1ml醋酸并搅拌，加无菌水定容到1L，室温下保存。
5) 美罗培南贮存液（10mg/ml）
6) 氨曲南贮存液（10mg/ml）
7) 头孢他啶贮存液（10mg/ml）
8) 左氢氟沙星贮存液（10mg/ml）
9) 庆大霉素贮存液（30mg/ml）
10) 5mol/L NaOH:称取200g 氢氧化钠倒入有800ml水的烧杯中，要一边加一边用搅拌，待溶质溶解完全，将溶液定容到1L。
11) 0.1M CaCl2：称取无水氯化钙11.1g，玻璃棒搅拌至完全溶解，将溶液定容到1L。
12) 酶：DNA Marker（来自美国Fermentas公司）、DNA限制性内切酶： Hind III，Eco RI（来自美国Invitrogen公司，Fermentas公司）、T4 DNA连接酶（来自美国Invitrogen公司）、Vent DNA polymerase（来自美国NEB公司）