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稀土元素镧对淡水涡虫再生中干细胞相关基因的表达影响(2)
2.将DNase I干粉(1500 U)溶解在550μl RNase-Free ddH2O中,轻柔混匀,分装后-20℃贮存。
3.操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%。同时使用前还要在漂洗液RW中加入无水乙醇,加入量参考说明书。
二、操作过程:
1.匀浆处理:
取10-20 mg组织加300μl裂解液RL,用研磨杵将组织彻底研磨;随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K,混匀后56℃处理10-20 min。
2.12,000 rpm(~13,400×g)离心2-5 min,取上清进行以下操作。
3.缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇,混匀,得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
4.向吸附柱CR3中加入350μl 去蛋白液RW1,12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec,弃
废液,将吸附柱放回收集管中。
5.DNase I 工作液的配制:取10μl DNase I 储存液放入新的RNase-Free离心管中,加入70μl RDD溶液,轻柔混匀。
6.向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I 工作液,室温放置15 min。
7.向吸附柱CR3中加入350μl 去蛋白液RW1,12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec,弃
废液,将吸附柱放回收集管中。
8.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(已加入乙醇),室温静置2 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
9.重复步骤8。
10.12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11. 将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O,室温放置2 min,12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min,得到RNA溶液,放于-70℃保存。
1.2.4 RT-PCR
结合研究淡水涡虫干细胞常规基因,利用Primer 5.0
软件
设置EF2(内参)、PCNA,HSP90,HSP70四对引物。进行10ml体系PCR,引物及条件见表1。 产物经琼脂糖凝胶电泳,然后通过荧光凝胶成像仪检测结果。
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