褪黑素对油菜幼苗盐胁迫相关基因及mircoRNA表达的影响(2)
褪黑素参与各种植物的生物以及非生物胁迫。在甘草（Glycyrrhiza uralensis）中，中波紫外光照射这种辐射胁迫下会显著提升甘草根部褪黑素的含量[10]。褪黑素处理渗透胁迫下的黄瓜可以发现，褪黑素显著上调了过氧化物酶等一系列保护性的基因水平，并且降低了细胞内部的毒性自由基水平，保护了包括叶绿体在内的质膜的完整，保证了光合作用的有效进行[11]。同时，褪黑素还有帮助抵挡重金属胁迫的能力，如对豌豆施加褪黑素可以显著提高豌豆在含铜离子土壤中的存活率[12]这一方面是由于褪黑素的化学结构所带来的螯合效应而产生解毒效果，另一方面是来自于褪黑素的修复损伤能力。
在褪黑素与植物盐胁迫的关系方面，使用褪黑素处理大豆种子可以有效的增加大豆种子在不良条件，如盐胁迫下的发芽率。转录组报告结果显示了包括碳代谢，光合作用，细胞分裂，抗坏血酸合成，氧化还原酶，次生代谢在内的多个生理生化过程都可能参与了褪黑素的相应过程来完成对盐胁迫等损伤的缓解[13]。使用褪黑素对黄瓜种子在萌发前进行预处理，在盐胁迫下，除了包括过氧化物酶，超氧化物歧化酶等在内的氧化还原酶系水平的上调之外，还发现了包括赤霉素以及脱落酸在内的植物激素水平的改变。脱落酸分解相关基因上调，与此同时，赤霉素合成基因水平也发生了上升。由此不难看出，褪黑素与植物激素之间也有交互作用[14]。在对盐胁迫下番茄进行施加褪黑素时，除了可以发现包括过氧化氢酶，超氧化物歧化酶等氧化还原酶水平的变化之外，还可以发现番茄中的脯氨酸以及各种可溶性蛋白质水平的上升，这会使番茄细胞的渗透压提高，从而对抗盐胁迫，防止其造成的失水损伤，于此同时，甚至连番茄之中的营养物质以及风物质的水平都有所提高[15]。
这些以前的研究中以油菜这一种重要的经济作物，油料作物作为研究材料的还较少。同时，涉及到mircoRNA这一新发现的调控体系的研究也较少。为了填补这一方面的缺少，本研究采用油菜为实验材料，并对mircoRNA进行了检验。这一实验结果，可以进一步了解植物耐盐机制，并且为开发新型耐压油菜的育种工作提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料
实验所选用的油菜种子为甘蓝型油菜（Brassica napus），品种为中双11号（Zhongshuang 11）。褪黑素购买自Sigma-Aldrich。qPCR试剂TransStrart Top Green qPCR SuperMix，mRNA反转录试剂TransScript Reverse Transcriptasw [M-MLV, RNaseH-]，总RNA提取试剂TransZol购买自TransGen Biotech。microRNA反转录试剂Mir-X miRNA First-Strand Synthesis购买自Clontech。
1.2. 褪黑素浓度的筛选
为了后续步骤中筛选所需要的最适合的褪黑素浓度，首先进行了预实验。首先将中双11号的油菜种子浸泡在百分之二（v/v）的次氯酸钠溶液稀释液中10分钟进行简单的消毒，然后将种子放置于流动的自来水下冲洗半个小时，以将次氯酸钠完全清洗干净，防止残余的次氯酸钠影响种子发芽。种子浸泡于去离子水中12小时过夜后，将种子铺在垫有滤纸的培养皿中，培养皿中加少量去离子水，使去离子水浸没种子，放置于25摄氏度培养箱中，24-48小时使种子发芽。待种子出芽后，将种子接入由离心管盒改造成的培养盒中，培养液为二分之一霍格兰氏液，转入光照培养箱中培养。在光照培养箱中，每隔一天更换一次培养液。三天后，种子的两片子叶由黄转为绿色时，油菜幼苗准备完成，在这之后的油菜幼苗都遵循着同样的方法制备。将购买来的褪黑素粉末溶解于乙醇中，制成100 mM的储存液，保存于-20摄氏度的冰箱中，由于褪黑素见光分解，因此需要避光保存。首先，使用褪黑素预处理油菜幼苗。配置含有0 μM、0.01 μM、0.1 μM、1 μM、10 μM和100 μM的褪黑素的二分之一霍格兰氏液，将油菜幼苗根部浸泡于上述的培养基之中，放回光照培养箱后处理12小时。经过梯度浓度的褪黑素预处理的幼苗，被转入含有150 mM的氯化钠的二分之一霍格兰氏液中，处理24小时。处理完毕后，记录30根油菜幼苗地下部的鲜重，并选取鲜重最大的褪黑素浓度作为这之后所有实验的浓度（1 μM）。